王炜灵 李蔚华

基础研究

重组人促红细胞生成素保护缺血再灌注大鼠心肌微循环的机制探讨

王炜灵 李蔚华

目的 探讨重组人促红细胞生成素（rhEPO）保护缺血再灌注大鼠心肌微循环的机制。方法将60只雄性SD大鼠随机分为SHAM组、IR组和rhEPO组，每组20只。SHAM组假手术处理后30 min，腹腔注射0.5 ml生理盐水。IR组和rhEPO组大鼠缺血30 min，再灌注1 h；再灌注开始时，IR组大鼠腹腔注射0.5 ml生理盐水，rhEPO组腹腔注射5000 U/kg rhEPO（加生理盐水稀释至0.5 ml）。ELISA法检测心肌NO和eNOS含量，Western blot法检测心肌p-Akt和Akt蛋白表达，免疫组化法检测VEGF和CD31的阳性表达，HE染色观察心肌微结构变化，墨汁灌注的方法计数新生血管数。结果 与IR组相比，rhEPO组心肌中NO、eNOS、p-Akt的表达量明显增加（P＜0.01），p-Akt/Akt比值明显增大（P＜0.01）；VEGF和CD31的表达明显增加（P＜0.05）；心肌微结构损伤明显减轻；墨汁灌注的毛细血管数明显增加（P＜0.01）。与SHAM组相比，rhEPO组心肌组织的NO、eNOS、p-Akt的表达量明显增加（P＜0.05），p-Akt/Akt明显增大（P＜0.01）；VEGF和CD31的表达明显增加（P＜0.05）。结论 rhEPO保护缺血再灌注大鼠心肌微循环，可能的机制是与PI3K/AkteNOS-NO信号途径促进新生血管的生成相关。

重组人促红细胞生成素； 缺血再灌注损伤； 冠脉微循环

急性心肌梗死（AMI）是急诊抢救中常见的危重症，及时有效恢复心肌的血液灌注，挽救濒死的心肌是抢救成功的关键[1]。但再灌注会造成损伤，减少缺血再灌注损伤是提高心梗患者溶栓治疗成功率和存活率的关键。促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）可减轻心脏缺血再灌注损伤，发挥心脏保护作用，本研究旨在探讨其机制，为临床用药提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 小动物呼吸机（奥尔科特、ALCV8S）；酶标仪（Rayto，Rt2100c）；紫外可见分光光度计（上海现科仪器有限公752-p）；重组人EPO（rhEPO）注射液（益比奥，沈阳三生）；NO和eNOS检测试剂盒（南京建成A012和H195）；SABC免疫组化试剂盒（谷歌，货号GB13007）；DAB显色试剂盒（谷歌，K5007）；p-Akt和 Akt一抗（CST#4060，CST#4691）；HRP标记山羊抗兔 IgG（谷歌，GB23303）；β-actin（谷歌，GB13001-3）；VEGF和CD31一抗（博世德BA0407和BA2966）等。

1.2 研究对象 60只健康雄性SD大鼠，SPF级，购于湖北省疾控中心。动物质量合格证号：42000600009468。实验前适应性喂养1周，体重（253±8.4）g，造模前大鼠禁食12 h，不禁水。实验过程中对大鼠的处置符合动物伦理学标准。将60只大鼠随机分为3组：SHAM组（假手术组）、IR组和rhEPO组，每组20只大鼠。

1.3 方法

1.3.1 大鼠心脏缺血再灌注模型的建立 大鼠仰卧位固定，腹腔注射4%水合氯醛麻醉，气管插管后立即连接小动物呼吸机（呼吸频率110次/min）。打开胸腔，剪开心包膜，左心耳根下缘约2 mm处用5-0丝线穿过心肌层，连同直径2 mm的塑料胶管结扎冠状动脉左前降支；结扎30 min后，剪开结扎线再灌注60 min。冠脉结扎成功的标志：结扎远端心肌颜色变紫，心电图表现为ST段抬高和（或）T波高耸。再灌注损伤模型成功标志：缺血部位心肌颜色基本恢复，抬高的ST段下降50%以上。EPO治疗组在解除结扎后立即腹腔注射5000 U/kg的rhEPO（用生理盐水稀释至0.5 ml），假手术组和IR模型组注射等量生理盐水。

1.3.2 心脏标本的留取 术后立即处死大鼠并摘取心脏组织，用刀片在结扎点至心尖连线中点处切取1.5~2.0 mm心内膜下心肌组织，浸泡于40%的多聚甲醛中，用于HE染色及免疫组化染色，剩余标本置于-80℃冰箱保存。

1.3.3 ELISA法检测心肌组织中的NO、eNOS 称适量的组织，用9倍的生理盐水研磨，然后将研磨液以3000~4000 r/min离心10 min，取上清放入4℃的冰箱待测。NO的检测：①按照说明书步骤加入样本和R1、R2混合试剂，37℃水浴60 min。②加入R3、R4，抽提室温静置40 min，3500~4000 r/min离心10 min。③取上清0.5 ml，加入显色剂，静置10 min，置于分光光度计波长550 nm处，0.5 cm光径比色皿，双蒸水调零，比色，记下数值。eNOS的检测：①按照说明书配制标准品液、标本稀释液和洗涤液。②加样，每孔各加入标准品或待测样品100 μl，将反应板充分混匀后置37℃120 min。③洗板，用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次，向滤纸上印干。④每孔中加入第一抗体工作液100 μl，将反应板充分混匀后置37℃60 min。洗板（同上）。⑤每孔加酶标抗体工作液100 μl，将反应板置37℃30 min。洗板（同上）。⑥每孔加入底物工作液100 μl，置37℃暗处反应15 min。⑦每孔加入100 μl终止液混匀，30 min内用酶标仪在450 nm处测吸光值。

1.3.4 Western bolt法（WB）检测p-Akt及Akt的蛋白表达及p-Akt/Akt的比值 ①将50 mg心肌组织放入玻璃匀浆器中，加入细胞裂解液、PMSF裂解液、cocktail和磷酸酶抑制液（A液和B液），冰浴上匀浆。②12 000 r/min离心15 min，取上清液即为总蛋白。BCA法测定总蛋白浓度。③取10 μl蛋白样品，煮沸使蛋白变性，10%SDS-PAGE电泳60 min，冰浴中恒电流276 mA转移至PVDF膜上。④Akt用5%脱脂奶粉封闭2 h，p-Akt用5%BSA封闭2 h。然后TBST清洗3次，每次10 min。加入一抗（1∶1000和1∶2000），4℃孵育过夜。⑤TBST洗膜后加入辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗兔IgG抗体（二抗1∶3000）孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，用ECL发光液曝光。用凝胶成像分析仪扫描各条带。Quantity One软件分析灰度值。以β-actin作为内参，灰度值以各蛋白与内参的灰度值比值来表示。

1.3.5 SABC免疫组化法分析VEGF及CD31的表达 石蜡切片脱蜡至水，柠檬酸（PH6.0）修复液沸腾后计时2 min。PBS洗涤3次，每次5 min。切片放入3%过氧化氢溶液避光孵育25 min，以去除内源性过氧化物酶，将玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。在组化笔圈内滴加3%BSA室温封闭30 min；甩掉封闭液，滴加一抗（1∶1000和1∶1500），4℃孵育过夜。PBS洗3次，加二抗（1∶2000）孵育50 min。加DAB显色液，显微镜下控制显色时间，自来水冲洗切片，终止显色。苏木素复染3 min左右，1%的盐酸酒精风化数秒，返蓝，流水冲洗；脱水，中性树胶封片。采集图像，用Image-ProPlus 6.0软件分别测量IOD（积分光密度）和A（面积），计算出AIOD值。

1.3.6 HE染色 在冠状动脉左前降支结扎点至心尖连线中点处取2 mm左右心内膜下心肌组织，放入甲醛中固定，切片，行HE染色，观察心肌组织的形态结构。

1.3.7 墨汁灌注法观察冠脉毛细血管墨汁灌流数 再灌注结束后每组各取5只大鼠，由心尖进针，穿入左心室，灌注生理盐水［压力不超过90～110 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）］，然后剪开右肺叶观察流出液的颜色。当流出液呈无色透明时，改用墨汁与低分子右旋糖酐以7∶3比例配制而成的墨汁灌注液继续灌注，观察全身颜色的变化，至逐渐变为均匀暗灰色时取出心脏，于10%甲醛固定后，做石蜡切片。每只大鼠随机选3张200×的病理切片图像，每张切片图像分别取3个视野（左室前壁外层、左室前壁中内层、室间隔前2/3），以Image-ProPlus图像分析软件计毛细血管的数目（镜下呈黑色点状或条状）。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。实验数据以±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较，组内比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA结果 与SHAM组相比，IR组大鼠心肌组织的NO含量明显增加（P＜0.01），eNOS的含量未见统计学差异。与IR组相比，rhEPO组大鼠心肌组织的NO和eNOS含量明显增加（P＜0.01）。与SHAM组相比，rhEPO组大鼠心肌组织的NO和eNOS含量明显增加（P＜0.01）。见图1。

2.2 WB结果 三组大鼠心肌组织中Akt的表达量无差异。与SHAM组相比，IR组大鼠心肌组织中p-Akt的表达量明显增加（P＜0.05），p-Akt/Akt明显增大（P＜0.01）。与IR组相比，rhEPO组大鼠心肌组织中p-Akt的表达量明显增加（P＜0.05），p-Akt/ Akt明显增大（P＜0.01）。与SHAM组相比，rhEPO组大鼠心肌组织中p-Akt的表达量明显增加（P＜0.05），p-Akt/Akt明显增大（P＜0.01）。见图2。

2.3 免疫组化结果 与IR组相比，rhEPO组大鼠心肌组织中VEGF和CD31表达均明显增加（P＜0.01）。与SHAM组相比，IR组大鼠心肌组织中VEGF和CD31表达均明显增加（P＜0.05）。见图3、4。

2.4 HE染色结果 与SHAM组相比，IR组大鼠心肌细胞水肿、坏死融合成片，胶原纤维网断裂，可见炎性细胞浸润。与IR组相比，rhEPO组上述形态学表现均明显减轻。见图5。

2.5 墨汁灌注结果 与IR组相比，rhEPO组大鼠的心肌毛细血管灌流数明显增加（P＜0.01）。IR组大鼠心肌血管灌流数明显减少，甚至出现无复流现象，但是IR组大鼠心肌不同部位的新生血管数均明显多于SHAM组。见图6、7。

3 讨论

有研究发现，EPO在肾脏、肠道、心脏等器官的缺血再灌注模型中，能够减轻缺血再灌注损伤，其机制可能与磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信号传导途径有关[2-4]。蔡智慧等[5]发现，在大鼠缺血再灌注模型中，联合使用EPO和氟伐他汀能增加血液中NO的含量，提高内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的活性，且效果更明显，能够减轻大鼠的缺血再灌注损伤，发挥心肌保护作用。在心肌细胞中，EPO和促红细胞生成素受体（Erythropoietin receptor，EPOR）相互作用的心脏保护作用，好像是由PI3K-Akt-eNOS信号途径调节的，上述途径是急性应答[6]。有报道称，在缺血再灌注损伤中，一氧化氮（Nitric oxide，NO）可舒张血管、减少凋亡、保护器官[7-9]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是特异性作用于内皮细胞的糖基化细胞有丝分裂素，在增强血管的渗透性、血管生成，以及内皮细胞生长、促进细胞迁移、抑制细胞凋亡等方面发挥作用。血小板-内皮细胞黏附分子（platelet endothelial celladhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）是血管内皮的重要标记物，对新生血管内皮细胞的标记特异性很强，并参与血管新生过程，有效地反映血管新生的程度[10]。

EPO减轻大鼠心脏的缺血再灌注损伤，可能的机制是EPO与EPOR结合后，激活PI3K/AkteNOS-NO信号途径，继而保护心肌细胞和心肌微循环。在心脏缺血再灌注损伤中，PI3K/Akt激活后，减轻心肌凋亡和炎症；EPO诱导冠脉内皮细胞产生eNOS，继而上调NO的生成量，使冠状动脉舒张，增加冠状动脉的血流灌注。在心脏缺血再灌注损伤中，EPO诱导上调VEGF和CD31的表达量，对新生血管的生成起促进作用，从而减轻缺血再灌注损伤。

Ali-Hassan-Sayegh等[11]对经皮冠脉再通术后的患者应用EPO是否有保护效应做了荟萃分析。该分析显示，短期应用EPO在心脏功能、梗死面积的减少和全因死亡率方面并没有改善。低剂量的EPO治疗可能不是心梗患者的选择，高剂量可能更有效。众所周知，EPO必须在梗死时立即应用，才能达到更好的心脏保护作用，然而在临床实践中通常提供不了这样的便利。

对于EPO能否减轻心脏缺血再灌注损伤，保护心肌微循环，需要更深入的研究，比如EPO的应用剂量、应用时间、作用机制等。这些研究在临床上将有助于改善AMI患者冠脉再通术后的预后。

（本文图片见后插二、三）

［1］刘健，熊玮珏，王伟民.《2015年美国心脏病学会/美国心脏协会/美国心血管造影与介入学会 ST段抬高心肌梗死患者处理指南更新》解读.中国介入心脏病学杂志，2016，24：607-611.

［2］Zhang J，Zou YR，Zhong X，et al.Erythropoietin pretreatment ameliorates renal ischaemia-reperfusion injury by activating PI3K/ Akt signaling.Nephrology，2015，20：266-272.

［3］Kai-lan W，Si Z.Pretreatment with erythropoietin attenuates intestinal ischemia reperfusion injury by further promoting PI3K/Akt signaling activation.Transplantation Proceedings，2015，47：1639-1645.

［4］Rong R，Xijun X.Erythropoietin pretreatment suppresses inflammation by activating the PI3K/Akt signaling pathway in myocardial ischemia-reperfusion injury.Exp Ther Med，2015，10：413-418.

［5］蔡智慧，王兴红.促红细胞生成素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护机制.中国医疗前沿，2012，7：6.

［6］Ghezzi P，Conklin D.Tissue-protective cytokines：structure and evolution.MethodsMol Biol，2013，982：43-58.

［7］Gliemann L，Nyberg M，Hellsten Y.Nitric oxide and reactive oxygen species in limb vascular function：what is the effect of physical activity?Free Radic Res，2014，48：71-83.

［8］Dziodzio T，Biebl M，Pratschke J.Impact of brain death on ischemia/reperfusion injury in liver transplantation.Curr Opin Organ Transplant，2014，19：108-114.

［9］Zhang W，Han Y，Meng G，et al.Direct renin inhibition with aliskiren protects against myocardial ischemia/reperfusion injury by activating nitric oxide synthase signaling in spontaneously hypertensive rats.J Am Heart Assoc，2014，3：e000606.

［10］卞中国.重组人促红细胞生成素对大鼠创伤性脑损伤血管新生的影响及相关机制研究.苏州大学硕士论文，2014.

［11］Ali-Hassan-Sayegh S，Mirhosseini SJ，Tahernejad M，et al. Administration of erythropoietin in patients with myocardial infarction：does it make sense?An updated and comprehensive meta-analysis and systematic review.Cardiovasc Revasc Med，2015，16：179-189.

The study of mechanism how rhEPO protect myocardial microcirculation of rat with ischemia-reperfusion injury

WANG Wei-ling，LI Wei-hua.Department of Cardiology，Liyuan Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430077，China Corresponding author：LI Wei-hua，E-mail：liwh80@163.com

Objective The study investigates the mechanism how rhEPO protect myocardial microcirculation of rat with ischemia-reperfusion injury.MethodsSixty male SD rats were randomly divided into sham operation group，ischemia-reperfusion group and recombinant human erythropoietin group.0.5 ml saline intraperitoneal in SHAM group was injected.Myocardial ischemia was done for 30 minutes and then reperfusion for 1 hour to the rats in IR group and rhEPO group.At the beginning of reperfusion，0.5 ml saline was injected intraperitoneal in IR group and 5000 U/Kg rhEPO（which is diluted to 0.5 ml by saline）in rhEPO group.The production of NO and eNOS were detected by ELISA，the protein expressions of p-Akt and Akt were determined by Western Blot，the positive protein expression of VEGF and CD31 were determined by IHC.Myocardium were stained by HE staining，the counting of newborn capillary vessels by ink reperfusion.ResultsCompared with IR group，the production of NO，eNOS，p-Akt and the ratio p-Akt/Akt were obviously higher in rhEPO group（P＜0.01），the positive protein expression of VEGF and CD31 were obviously increased（P＜0.05），the myocardial microstructure revealed lighter injury，the quantity of reborn capillary vessels by ink reperfusion increased obviously（P＜0.01）.Compared with SHAM group，the production of NO，eNOS，p-Akt and the ratio p-Akt/Akt were obviously higher in rhEPO group（P＜0.01），the positive protein expression of VEGF and CD31 were obviously increased（P＜0.05）.ConclusionrhEPO protects myocardial microcirculation in rats which suffer from ischemia reperfusion.Its probable mechanism is related with the PI3K/Akt-eNOS-NO signal pathway and the angiogenesis effect of rhEPO.

rhEPO； Ischemia reperfusion injury； Coronary microcirculation

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.07.022

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）07-0664-04

2016-12-03）

湖北省自然科学基金计划面上项目（项目编号：CGZ0095）

430077 湖北省武汉市，华中科技大学同济医学院附属梨园医院心内科

李蔚华，E-mail：liwh80@163.com