汪秋安, 乔艳欣, 毛 炎, 刘 多

(湖南大学 化学化工学院, 湖南 长沙 410082)

4-甲基伞形内酯衍生物的合成与生物活性研究

汪秋安*, 乔艳欣, 毛 炎, 刘 多

(湖南大学 化学化工学院, 湖南 长沙 410082)

4-甲基伞形内酯(4-甲基-7-羟基香豆素, 1)是一种具有重要生物活性的香豆素类天然产物. 本文以间苯二酚和乙酰乙酸乙酯为原料, 经Pechmann反应合成4-甲基伞形内酯(1). 然后以4-甲基伞形内酯(1)为底物, 分别经Mannich反应、乙酰化、Fries重排、O-甲基化、Baeyer-Villiger氧化、O-异戊烯基化和Claisen重排等反应步骤, 合成了一系列4-甲基伞形内酯衍生物2～10.并对所合成的化合物进行了人宫颈癌Hela细胞的抑制活性测试, 结果发现新化合物4-甲基5-异戊烯基-8-羟基-7-甲氧基香豆素(10)对Hela细胞的抑制活性(IC50= 28.58 μmol/L), 高于阳性对照药物顺铂(IC50= 41.25 μmol/L), 具有进一步研究开发的价值.

4-甲基伞形内酯； 香豆素衍生物； 合成； 生物活性

香豆素是一类具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和抗凝血作用等重要生物活性的天然产物. 例如,Kashman等从马来西亚热带雨林树木藤黄科胡桐树(Calophyllumlanigerum)中分离出来的Calandide具有很强的抗艾滋病毒活性[1]. 2003年Lee等从缅甸的KayeaOssamica树皮中分离得到的新香豆素TheraphinsA, B和C显示出很好的抗Co12, KB和LNCaP人肿瘤细胞活性[2]. 张庆林等从蛇床子(Cnidiummonnier)中分离出的3种香豆素对耐药的肿瘤细胞KBV200具有明显的逆转作用[3]. Itoigawa等从C.inophllum中分离出的10种4-苯基香豆素对肿瘤细胞Epstein-Barr Virus(EBV)具有显著抑制活性[4].

4-甲基伞形内酯(1)是一种简单的天然香豆素, 它对各种肿瘤细胞具有抑制活性, 同时也是一种新型利胆药物[5-6]. 由于它的分子量小、合成简便且生物利用度高, 由4-甲基伞形内酯所衍生出来的香豆素衍生物显示出良好的生物活性和药理作用, 已引起人们的广泛关注[7-10]. 现有的研究表明, 异戊烯基、甲氧基和含氮碱基对香豆素类化合物的生物活性具有增强效果, 例如, 蛇床子素(osthol, 7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素)是近年来发现的一种很有潜力的高效抗肿瘤的异戊烯基香豆素[11]. 为了进一步研究4-甲基伞形内酯衍生物的生物活性及适应新药开发的需要, 我们首先以间苯二酚和乙酰乙酸乙酯为原料, 经Pechmann反应合成了4-甲基伞形内酯(1), 然后对4-甲基伞形内酯进行结构修饰, 分别经Mannich 反应、乙酰化、Fries重排、O-甲基化、Baeyer-Villiger氧化、O-异戊烯基化和Claisen重排等反应, 合成了一系列4-甲基伞形内酯衍生物2～10.并对所合成的4-甲基伞形内酯衍生物进行了人宫颈癌Hela细胞的抑制活性测试. 4-甲基伞形内酯(1)及其衍生物2～10的合成路线如图1所示.

Reagents and conditions: a. H2SO4, r.t.; b. 37% HCHO(aq), amine, C2H5OH, H+, microwave(600 W, 80 ℃); c. Ac2O, DMAP; d. AlCl3, Δ; e. (CH3)2SO4, acetone, K2CO3; f. H2O2; g. prenyl bromine, acetone, K2CO3; h. microwave (600 W, 200 ℃), DEA.

图1 4-甲基伞形内酯(1)及其衍生物2～10的合成路线

Fig.1 Synthetic routes of 4-methylumbelliferone (1) and its derivatives 2～10

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

熔点在 XRC-1 型显微熔点仪上测定(温度计未校正)；NMR 用 Bruker Am-400 型核磁共振仪测定(溶剂 CDCl3或 DMSO-d6, TMS 为内标)；MS 用 Agilent 1100 液-质联用仪或 ZAB-HS 型仪测定记录(EI模式)；IR用 FD-5DX 仪 (KBr 压片法)测定；微波加热用XH-MC-1实验室微波合成仪(北京祥鹄科技发展有限公司)；薄层和柱层析用硅胶均为青岛海洋化工厂产品；所用试剂和溶剂为化学纯和分析纯, 要求无水的溶剂都经过干燥剂或分子筛除水和重蒸处理.

4-甲基-7-羟基香豆素(1)按文献以间苯二酚和乙酰乙酸乙酯为原料合成[12].

1.2 4-甲基-7-羟基-8-亚甲基(1-二正丙胺)香豆素(2)合成

首先将0.8 mL甲醛、0.8 mL二正丙胺、5滴浓盐酸溶于5 mL乙醇中, 室温下搅拌10 min, 再称取化合物1 (200 mg, 1.14 mmol) 于100 mL加有磁子的圆底烧瓶中, 将20 mL无水乙醇加入其中, 微波条件(600 W, 80 ℃)下溶解原料, 回流30 min左右, 反应完毕, 旋干反应液, 加水, 用乙酸乙酯萃取3次, 无水硫酸钠干燥, 过滤, 旋蒸除溶剂,用乙酸乙酯-石油醚重结晶, 得到黄色固体165 mg, 产率50%, m.p. 125～127 ℃,1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.24 (d,J= 8.5 Hz, 1H, 5-H), 6.57 (d,J= 8.5 Hz, 1H, 6-H), 5.88 (s, 1H, 3-H), 3.91 (s, 2H, NCH2), 2.41 (t,J= 6.9 Hz, 4H, NCH2), 2.25 (s, 3H, 4-CH3), 1.46～1.49 (m, 4H, CH2), 0.78 (t,J= 6.7 Hz, 6H, CH3).13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ163.09, 160.84, 153.22, 152.20, 124.28, 113.16, 111.59, 109.98, 108.08, 55.47, 50.79, 19.18, 18.55, 11.55. MS (EI),m/z: 289 [M]+. Anal. calcd for C17H23O3N: C 70.56, H 8.01, N 4.84；found C 70.48, H 7.98, N 4.81.

1.3 4-甲基-7-羟基-8-亚甲基(1-吡咯烷)香豆素(3)的合成

合成方法同(2)得到黄色固体201 mg, 产率68%, m.p. 223～225℃,1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ13.08 (s, 1H, OH), 7.32 (d,J= 8.7 Hz, 1H, 5-H), 6.67 (d,J= 8.7 Hz, 1H, 6-H), 5.97 (s, 1H, 3-H), 4.10 (s, 2H, NCH2), 2.65 (s, 4H, NCH2), 2.30 (s, 3H, 4-CH3), 1.81 (s, 4H, CH2).13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ163.13, 161.37, 153.46, 152.02, 124.49, 113.37, 111.91, 110.34, 108.60, 77.46, 77.14, 76.82, 53.60, 51.43, 23.70, 18.83. MS (EI),m/z: 259 [M]+. Anal. calcd for C15H17O3N: C 69.48, H 9.51, N 7.77；found C 69.57, H 9.38, N 7.83.

1.4 4-甲基-7-羟基-8-亚甲基(4-羟基哌啶)香豆素(4)的合成

合成方法同(2)得到黄色固体214 mg,产率65%, m.p. 150～152 ℃,1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.39 (d,J= 8.7 Hz, 1H, 5-H), 6.75 (d,J= 8.7 Hz, 1H, 6-H), 6.05 (s, 1H, 3-H), 4.04 (s, 2H, NCH2), 3.84 (s, 1H, CH(OH)), 2.92 (s, 2H, NCH2), 2.37 (s, 5H, NCH2and 4-CH3), 1.95 (s, 2H, CH2), 1.68 (s, 2H, CH2).13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ162.71, 161.36, 153.48, 152.40, 124.60, 113.44, 112.16, 110.49, 107.72, 53.81, 33.84, 29.92, 18.79. MS (EI),m/z: 289 [M]+. Anal. calcd for C16H19O4N: C 66.42, H 6.62, N 4.84；found C 66.36, H 6.70, N 4.75.

1.5 4-甲基-7-乙酰氧基香豆素(5)的合成

称取化合物1 (500 mg, 2.85 mmol), 催化量的4-二甲氨基吡啶于100 mL圆底烧瓶中, 加入15 mL乙酸酐,50 ℃反应2 h, 原料点几乎消失, 停止反应,旋干反应液, 用乙酸乙酯萃取3次, 饱和食盐水洗涤, 干燥, 旋干溶剂, 最后用二氯甲烷-石油醚重结晶, 得到白色固体497 mg, 产率80%, m.p.142～144℃,1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.54 (d,J= 8.4 Hz, 1H, 5-H), 7.07～6.98 (m, 2H, 6-H and 8-H), 6.20 (s, 1H, 3-H), 2.36 (s, 3H, 4-CH3), 2.28 (s, 3H,COCH3).13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ167.80, 159.51, 153.09, 151.97, 150.96, 124.40, 117.10, 116.82, 113.47, 109.44, 20.12, 17.74. MS (EI),m/z: 218 [M]+. Anal. calcd for C12H10O4: C 66.05, H 4.62；found C 65.96, H 4.63.

1.6 4-甲基-8-乙酰基-7-羟基香豆素(6)的合成

称取化合物5 (500 mg, 2.29 mmol), AlCl3(1 g, 7.49 mmol), 适量NaCl于100 mL圆底烧瓶中, 在140 ℃下反应24 h, 冷却, 滴加 10% 稀盐酸至酸性, 抽滤, 干燥, 用CH2Cl2溶解, 过滤, 最后重结晶, 得到黄色固体324 mg, 产率65%, m.p. 166～168℃,1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ13.45 (s, 1H, OH), 7.57 (d,J= 8.9 Hz, 1H, 5-H), 6.79 (d,J= 8.9 Hz, 1H, 6-H), 6.05 (s, 1H, 3-H), 2.82 (s, 3H, 4-CH3), 2.33 (s, 3H,COCH3).13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ204.32, 166.56, 159.31, 155.06, 153.07, 131.28, 115.06, 111.82, 110.98, 109.18, 33.91, 19.19. MS (EI),m/z: 218 [M]+. Anal. calcd for C12H10O4: C 66.05, H 4.62；found C 66.10, H 4.57.

1.7 4-甲基-8-乙酰基-7-甲氧基香豆素(7)的合成

将化合物6(500 mg,2.29 mmol), 碳酸钾(1.90 g, 13.74 mmol)放于圆底烧瓶中, 加入20 mL丙酮,40℃下加热使原料溶解, 滴加2 mL硫酸二甲酯, 5 h后, 原料点几乎没有, 停止反应, 旋干滤液, 重结晶, 得白色固体425 mg, 产率80%, m.p. 95～97℃,1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.57 (d,J= 8.9 Hz, 1H, 5-H), 6.89 (d,J= 8.9 Hz, 1H, 6-H), 6.11 (s, 1H, 3-H), 3.89 (s, 3H, OCH3), 2.57 (s, 3H, 4-CH3), 2.38 (s, 3H, COCH3).13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ199.47, 159.95, 158.37, 152.24, 150.51, 126.50, 119.19, 113.87, 112.41, 107.47, 56.28, 32.42, 18.73. MS(EI),m/z: 232 [M]+. Anal. calcd for C13H12O4: C 67.23, H 5.21；found C 67.16, H 5.25.

1.8 4-甲基-8-羟基-7-甲氧基香豆素(8)的合成

称量化合物7 (200 mg, 0.86 mmol) 于100 mL圆底烧瓶中, 加入15 mL二氧六环, 12 mL 4%氢氧化钠溶液, 40 ℃加热, 使原料溶解, 冰浴条件下将10 mL 30% 的双氧水溶液滴入其中, 反应3 h左右, 用冰的稀盐酸进行酸化使pH=1, 原料点几乎没有, 停止反应, 加水, 用二氯甲烷萃取3～4次, 萃取后, 饱和食盐水洗涤有机层, 干燥, 旋除溶剂, 最后重结晶, 得黄色固体89 mg, 产率50%， m.p. 80～82 ℃,1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.12 (d,J= 8.8 Hz, 1H, 5-H), 6.87 (d,J= 8.8 Hz, 1H, 6-H), 6.14 (d,J= 0.9 Hz, 1H, 3-H), 3.98 (s, 3H, OCH3), 2.39 (d,J= 1.1 Hz, 3H, 4-CH3).13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ160.17, 152.85, 149.30, 141.61, 132.75, 115.24, 114.38, 112.18, 107.30, 56.40, 18.61. MS(EI),m/z: 206 [M]+. Anal. calcd for C11H10O4: C 64.07, H 4.89；found C 64.11, H 4.78.

1.9 4-甲基-7-甲氧基-8-异戊烯氧基香豆素(9)的 合成 称量化合物8 (200 mg, 0.97 mmol), 无水碳酸钾(800 mg, 5.80 mmol)于100 mL圆底烧瓶中, 加入15 mL丙酮,40 ℃加热, 使原料溶解, 滴加0.2 mL异戊烯基溴, 反应4 h左右, 停止反应, 过滤, 旋转蒸除溶剂, 用二氯甲烷-石油醚重结晶, 得到黄色固体226 mg, 产率85%， m.p. 66～68 ℃,1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.29 (d,J= 8.9 Hz, 1H, 5-H), 6.87 (d,J= 8.9 Hz, 1H, 6-H), 6.13 (s, 1H, 3-H), 5.59 (td,J= 7.3, 1.3 Hz, 1H, CH), 4.64 (d,J= 7.3 Hz, 2H, OCH2), 3.94 (s, 3H, OCH3), 2.38 (s, 3H, 4-OCH3), 1.73 (s, 3H, CH3), 1.69 (s, 3H, CH3).13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ159.68, 154.80, 151.55, 147.13, 138.23, 133.96, 119.02, 118.43, 113.70, 111.32, 106.94, 69.00, 55.30, 24.80, 17.75, 16.97. MS(EI),m/z: 274 [M]+. Anal. calcd for C16H18O4: C 70.06, H 6.61；found C 70.11, H 6.55.

1.10 4-甲基-5-异戊烯基-8-羟基-7-甲氧基香豆素 (10)的合成

称量化合物 9 (200 mg, 0.73 mmol)于100 mL圆底烧瓶中, 加入15 mL无水N,N-二乙基苯胺, 微波条件(600 W, 200℃)下加热, 反应2 h左右, 原料点消失, 停止反应, 冷却至室温, 加入4%稀盐酸, 用二氯甲烷萃取3次, 萃取后用饱和NaCl溶液洗涤有机层, 无水硫酸钠干燥, 过滤, 旋蒸除溶剂, 硅胶柱层析 (V石油醚∶V乙酸乙酯=6∶1), 得到黄色固体70 mg, 产率35%,m.p. 123～125℃,1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ6.60 (s, 1H, 6-H), 6.04 (s, 1H, 7-H), 5.99 (s, 1H, CH), 5.06 (s, 1H, OH), 3.87 (s, 3H, OCH3), 3.56 (d,J= 5.5 Hz, 2H, CH2), 2.52 (s, 3H, 4-CH3), 1.62 (s, 3H, CH3),1.75(s,3H,CH3).13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ158.79, 153.83, 147.35, 142.27, 132.34, 130.81, 130.41, 122.29, 112.66, 111.83, 109.85, 55.21, 33.57, 24.54, 23.50, 17.13. MS(EI),m/z: 274 [M]+. Anal. calcd for C16H18O4: C 70.06, H 6.61；found C 69.95, H 6.59.

1.11 生物活性测试

采用CCK-8法对合成化合物1～10进行体外抗肿瘤细胞Hela(宫颈癌细胞)的活性筛选. 以顺铂 (cis-Platin )作为阳性对照. 实验流程如下：将每5 000个肿瘤细胞接种到96孔板中(每一孔板接种5 000个细胞), 待细胞贴壁之后(一般过夜或12 h)给药, 起始给药浓度100 μmol/L, 3倍或4倍浓度进行梯度稀释, 一共稀释8个浓度(如：稀释4倍,分别是100 μmol/L, 25 μmol/L, 6.25 μmol/L, 1.56 μmol/L, 0.39 μmol/L, 0.097 6 μmol/L, 0.024 4 μmol/L, 0.006 1 μmol/L), 给药后孵育培养48 h,弃去培养基, 加入含10% CCK-8(检测线号, 只与活细胞结合, 结合越多, 吸光度越大)的1640培养基(体外培养细胞所需的营养物质, 主要有糖、氨基酸和维生素三大类)100 μL, 孵育1～2 h, 检测波长范围450～490 nm, 酶联免疫检测仪(Bio-Rad 680)读取各孔光吸收值, 记录结果, 以浓度为横坐标, 细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线, 应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC50值.

2 结果与讨论

首先, 以间苯二酚和乙酰乙酸乙酯为原料, 经香豆素合成的经典反应Pechmann反应合成4-甲基伞形内酯(1). 然后,4-甲基伞形内酯(1)分别与二正丙胺、吡咯烷和4-羟基哌啶等3种二级胺和水合甲醛的酸性醇溶液, 在微波加热(600 W, 80 ℃)下进行Mannich反应, 因香豆素1环上8位上的电子云密度较大, 且处于酚羟基的邻位, 易发生具有亲电特征的Mannich反应, 生成8-位胺甲基取代的香豆素衍生物2～4, 这3种产物的结构通过1HNMR谱确证, 其中8位上的氢峰消失, 出现了δ2.41,4.10和4.04胺甲基氢的吸收峰. 微波促进的Mannich反应已见文献报道[13], 该法可大大缩短反应时间, 且副产物少, 产率高.

4-甲基伞形内酯(1)与乙酸酐在催化量二甲基吡啶(DMAP)作用下,发生乙酰化反应得到化合物5.化合物5在Lewis酸无水AlCl3催化作用下, 发生Fries重排, 可得邻位、对位羟基芳香酮类化合物, 本文的化合物5中因对位被占据, 故得到邻位重排产物6. 曾选用CS2或硝基苯作溶剂, 产率较低, 可能是溶剂中含有少量的水, 使部分无水AlCl3吸潮水解, 而使产率较低. 在无溶剂条件下, 于140 ℃反应24 h产率最高. 化合物6的7-位经O-甲基化作用得化合物7. 化合物7在双氧水中经Baeyer-Villiger氧化得8-位有酚羟基的化合物8. 化合物8与异戊烯基溴在无水K2CO3丙酮体系中, 经亲核取代反应得O-异戊烯基化合物9. 化合物9溶于无水N,N-二乙基苯胺(DEA)溶剂中, 在微波加热(600 W, 200 ℃)条件下, 发生Claisen重排得4-甲基-5-异戊烯基-7-甲氧基-8-羟基香豆素(10). 对所合成的4-甲基伞形内酯及其衍生物进行了体外抗人子宫颈癌细胞Hela细胞株的活性筛选,采用CCK-8法[14], 以顺铂(cis-Platin)为阳性对照物, 其结果见表1.从表1的生物活性结果可以看出, 化合物1, 5, 6, 7和10对Hela细胞增殖具有抑制作用, 其中化合物10(IC50=28.58 μmol/L)的活性高于阳性对照药物顺铂(IC50=41.25 μmol/L), 也高于其母体香豆素4-甲基伞形内酯(IC50= 71.99 μmol/L).

表1 化合物1～10对Hela细胞株的半数抑制浓度[IC50]

aused for positive control.

3 结 论

天然香豆素4-甲基伞形内酯经Mannich 反应、乙酰化、Fries重排、O-甲基化、Baeyer-Villiger氧化、O-异戊烯基化和Claisen重排等反应, 合成了一系列4-甲基伞形内酯衍生物2～10. 所合成的目标化合物经测试对人宫颈癌Hela细胞株的抑制活性, 发现异戊烯基香豆素10的活性(IC50=28.58 μmol/L)高于阳性对照物顺铂(IC50=41.25 μmol/L), 具有进一步研究开发的价值.

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Synthesis and Biological Activity of 4-Methylumbelliferone Derivatives

WANG Qiu-an†,QIAO Yan-xin,MAO Yan,LIU Duo

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Univ, Changsha, Hunan 410082, China)

4-Methylumbelliferone (4-methyl-7-hydroxycoumarin, 1) is a coumarins natural product with important biological activity. Firstly, 4-methylumbelliferone (1) was synthesized from resorcinol and ethyl acetoacetate by Pechmann reaction. Nine coumarin derivatives (2～10) were then synthesized through Mannich reaction, acetylation, Fries rearrangement, O-methylation, Baeyer-Villiger oxidation, O-prenylation and Claisen rearrangement from 4-methylumbelliferone (1). Their inhibitory activities on human cervical carcinoma Hela cells were evaluated in vitro. The biological testing results showed that 4-methyl-5-prenyl-8-hydroxy-7-methoxycoumarin (10, IC50 = 28.58 μmol/L) displayed stronger activity than the positive control drug cis-Platin (IC50 = 41.25 μmol/L), which is worthy of further study.

4-methylumbelliferone; coumarin derivatives; synthesis; biological activity

1674-2974(2016)12-0088-05

2016-05-13 基金项目：国家自然科学基金资助项目(J1210040), National Natural Science Foundation of China (J1210040) 作者简介：汪秋安(1962-)，男,湖南常德人,湖南大学教授 †通讯联系人，E-mail:WangQA@hnu.edu.cn

O625.12

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