■张 欣 贝盏临乔亚飞

(北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川 750021)

宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)，系茄科(Solanace⁃ae)枸杞属(Lycium L.)多年生落叶灌木，是唯一被载入《中国药典》的枸杞药用品种。枸杞全身是宝，《本草纲目》记载“春采枸杞叶，名天精草；夏采花，名长生草；秋采子，名枸杞子；冬采根，名地骨皮”。大量研究结果表明，植物多酚是一类广泛存在于植物体内重要的多元酚类次生代谢物质，具有吸收过多的太阳辐射、过滤UV(Ultra-Violet)和清除体内自由基等多种生理功能。随着植物多酚类成分在抗氧化、抗菌、抗病毒、抗微生物、调血脂和血糖等多方面活性的发现和阐明，植物多酚具有较强的清除自由基、抗氧化活性、抗衰老等生物活性功能，现已成为当前研究的热点之一。本文优化出枸杞鲜花多酚最佳提取方法，并进行体外DPPH的清除率、FRAP、对ABTS+的清除率、对的清除率等抗氧化能力研究，为今后枸杞鲜花鲜食等应用研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

枸杞鲜花，采集自宁夏银川市郊区银川育新枸杞种业有限公司枸杞种植地（东经106°5′19.07″，北纬38°30′32.98″）。

1.2 试验方法

1.2.1 确定影响提取率的因素及水平

采用微波提取法，以提取溶剂乙醇的浓度、提取时间、提取功率为试验的主要影响因素，见表1。

表1 单因素水平试验方案

1.2.2 多酚提取步骤

称取枸杞鲜花1.0 g，放入预冷的研钵中加液氮进行快速研磨成匀浆，并相应加入70 ml不同浓度的乙醇溶液，于不同微波提取时间、微波提取功率等条件下提取。待提取完成，将提取液冷却过滤、用蒸馏水定容至50 ml。

1.2.3 多酚含量的测定

参照程刘柯等方法测定多酚含量。

1.2.4 单因素水平试验

1.2.4.1 提取时间

提取功率为50 W，提取液浓度为60%，以提取时间为变量。方法按1.2.2进行。

1.2.4.2 提取功率

提取时间为100 s，提取液浓度为60%，以提取功率为变量。方法按1.2.2进行。

1.2.4.3 提取液浓度

提取功率为80 W，提取时间100 s，以提取液浓度为变量。方法按1.2.2进行。

1.3 响应面试验计算

综合单因素试验结果，并根据Design-Expert试验设计软件，对影响枸杞鲜花多酚提取率的提取时间、提取功率、溶剂浓度的三因素五水平进行试验分析。

1.4 抗氧化活性评价

用下列四种方法对最优条件下提取的枸杞鲜花乙醇水提物进行抗氧化活性评价：DPPH、ABTS+和FRAP、。

1.4.1 ABTS+法

ABTS+法根据米勒（1993）方法稍有改动。配制浓度为 7 mmol∕l ABTS+和 4.9 mmol∕l过硫酸钾的母液,等体积混合，室温，避光条件下静置12～16 h，制得ABTS+自由基储存液，使用时用无水乙醇稀释至734 nm处吸光度为0.7±0.02的应用液。取300 μl的枸杞鲜花提取液，加入3 ml ABTS应用液，充分混合，空白用无水乙醇代替样品液，室温下避光反应30 min后测定其在734 nm处的吸光度（无水乙醇空白）。以样品对ABTS+自由基的清除率来表示各抗氧化剂的抗氧化能力。

ABTS+清除率(%)=(l-A样品∕A对照)×100。

式中：A样品——样品管的吸光值；

A对照——对照管的吸光值。

1.4.2 DPPH法

DPPH（2,2-dyphenyl-1-picrylhydrazyl）自由基的清除方法依据Blois（1958）方法稍有改动。用无水乙醇配置浓度为500 μmol∕l的DPPH溶液。分别吸取0、40、80、120、140 μl的枸杞鲜花提取液∕抗坏血酸加入试管，分别加入1 ml DPPH，无水乙醇定容至5 ml。常温暗置30 min，在波长517 nm处测定吸光度并作抗坏血酸标准曲线图。

DPPH自由基清除率(%)=[l-(Ai-Aj)∕A0]×100。

式中：Ai——(DPPH+样品)反应前的吸光度；

Aj——(DPPH+样品)反应30 min后的吸光度；

A0——(DPPH+乙醇)的吸光度。

1.4.3 三价铁还原能力（FRAP）检测

采用FRAP法测定枸杞鲜花提取物铁还原力，在593 nm处测定其吸光度值，获得线性方程y=0.000 7x+0.000 5(R2=0.997 8)。以FeSO4溶液的标准曲线为对照，测得样品的提取物的FRAP值为497.9∕μl。

将0.5 ml∕l的柠檬酸盐缓冲液（pH值3.0）5.0 ml加入试管，加入1 ml 0.01%的NaNO2溶液，加枸杞鲜花乙醇水提取物500 μl，37℃水浴1 h。取此反应液1 ml加入干净的试管，并加入0.4%的对氨基苯磺酸溶液2 ml和0.2%盐酸α-萘胺1 ml，摇匀放置15 min后，用分光光度计在540 nm处测吸光度值，按下式计算清除率：

清除率(%)=(B0-B)∕B0×100。

式中：B0——未加样品溶液的空白试验（以超纯水代替）的吸光值；

B——不同浓度反应液的吸光值。

1.5 统计分析

所有的试验均是重复三次，并计算平均值，采用Origin 8.5软件进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果（见图1）

以没食子酸为标准品，获得多酚含量标品的曲线方程为：y=0.617 5x+0.014 3；R2=0.994 1。图1表明，随着提取时间的增加，没食子酸的提取率先增加，此后随着提取时间的增加，提取率降低，并在100 s时提取率达到最大0.048%；微波功率的增加，没食子酸的提取率先增加，然后降低，并在50 W时提取率达到最大0.043%；随着乙醇提取液浓度的增加，没食子酸的提取率先增加，然后降低，并在60%时提取率达到最大0.044%。

图1 提取时间、提取功率、提取液乙醇浓度对枸杞鲜花总多酚提取率的影响

2.2 响应面试验结果

采用Design-Expert软件进行曲面响应分析，结果见表2。

时间（t）、功率（W）、提取液乙醇浓度（c）变换为：A=t∕40-2.5，B=W∕25-3，C=c∕15-17∕3(t为实际提取时间，W为实际提取功率，c为实际提取液乙醇浓度)，以3次单因素试验所得的没食子酸提取率的平均值为响应值，结果见表3。响应面分析见图2、图3、图4。

结果表明，微波法提取枸杞鲜花没食子酸的最佳工艺条件为乙醇浓度78.6%，提取时间149 s，提取功率63.2 W，提取得率为0.057 4%。通过分析我们知道，单因素的情况下，时间的最高提取率为0.048%，功率的最高提取率为0.043%，浓度的最高提取率为0.044%。没有一个单因素的提取率高过理论值。采用Design-Expert对响应值与各因素进行回归拟合，得回归方程：

提取率(%)=0.053-4.80×10-3×A-5.18×10-3×B-1.38×10-3×C-1.96×10-3×A2-5.49×10-3×B2-1.61×10-3×C2。

表2 响应面分析数据

表3 响应面分析方案

图2 枸杞鲜花总多酚提取时间与提取功率响应面与等高线

图3 枸杞鲜花总多酚提取功率与溶剂浓度响应面与等高线

图4 枸杞鲜花总多酚提取时间与溶剂浓度响应面与等高线

由表4可知，模型的拟合度显著性为极显著，回归方程与试验拟合程度较好。各因素的显著程度表明了因素对试验结果的影响程度，其中提取功率显著，说明提取功率对试验得率影响显著。从F值分析，对提取率的影响：提取功率＞提取时间＞乙醇浓度。微波能使水或物质吸收微波而自发热，实现“体加热”。微波辐照会在非均质固体内部产生应力，起到破碎从而增大比表面积的作用。实际中的微波萃取原理，就是利用微波能来提高萃取率的一种新技术。

表4 枸杞鲜花没食子酸提取率回归分析结果

2.3 抗氧化活性评价

目前，有多种方法测定抗氧化活性，但大多数是针对物质清除某一种自由基而言，并不能反映出其总的抗氧化能力，因为物质总的抗氧化能力是物质清除不同的自由基或者是物质的不同活性成分、清除不同的自由基的有效和，鉴于物质在生物体内起作用的正是其总的抗氧化能力，因此用总的抗氧化能力(total anti-oxidant activity,TAA)来评价物质的抗氧化能力是很有必要的。

2.3.1 DPPH法

测定枸杞鲜花最优工艺提取物清除DPPH的能力，以抗坏血酸(VC)作阳性对照,测定结果显示(图5)，两者清除DPPH的能力随着浓度的增加而增强.且在图示范围内呈良好的线性关系。样品对DPPH的 IC50值是 1.470 1 mg∕l，VC 对 DPPH 的 IC50值是0.072 2 mg∕l。

表明枸杞鲜花提取液是一类较强的自由基消除剂，可能与其含有具自由基清除活性的多酚类化合物有关。

图5 样品、VC对DPPH清除率

2.3.2 FRAP法

采用FRAP法测定枸杞鲜花最优工艺提取物总还原力，测定结果显示，FeSO4溶液的浓度在200～100 0 μmol∕l与FRAP工作液反应，在波长为 593 nm处的吸光度呈线性关系。线性方程为：y=0.000 7x+0.000 5(R2=0.997 8)。以FeSO4溶液的标准曲线为对照，测得样品的提取物的FRAP值为497.9∕μl。

枸杞鲜花提取液为良好的电子供应者,它们所提供的电子可使Fe3+还原为Fe2+,说明枸杞鲜花具有抗氧化潜力,可用于开发抗氧化功能食品。

2.3.3 ABTS+法

测定枸杞鲜花最优工艺提取物清除ABTS+的清除能力（图6），ABTS+的OD734nm值在浓度40～350 μg∕l的范围内呈线性关系，当超过该范围时就趋于稳定，并在波长为734 nm处有最大OD值，当还原性物质的含量再增加时就不再呈现线性关系。线性方程为：y=272.594 0x+1.305 0(R2=0.991 4)。当清除率达到50%时，样品的浓度为0.178 6 mg∕l。

3 结论

宁夏枸杞是枸杞中唯一被纳入中国药典的枸杞种，枸杞为无限花序，每一茬的结果中都会有一大批花的掉落，这无疑是一种损失，如果能将没有结果的花加以利用，无疑将增加枸杞的“深加工链”。本试验的结果表明，枸杞鲜花提取液对DPPH、ABTS+、的IC50值分别是1.470 1、0.178 6 mg∕l和 0.413 3 mg∕l，而VC对DPPH的IC50值是0.072 2 mg∕l；IC50值越低表示更高的自由基清除能力，即枸杞鲜花多酚提取物对ABTS的清除率＞对的清除率＞对DPPH的清除率，但VC对DPPH的IC50值远小于样品对DPPH的值，说明VC对DPPH具有更强的清除能力。FRAP法在593 nm处测定的总还原力表明，枸杞鲜花多酚提取物的FRAP值为497.9∕μl。

图6 样品对ABTS+、清除率

有关枸杞花方面的研究，目前主要集中在枸杞的干花中的多糖、黄酮、多酚、色素等含量的提取及测定，另外也对枸杞干花进行了抗氧化活性的研究。枸杞干花和鲜花中的多酚和黄酮均有较好的抗氧化作用。通过比较枸杞干花和鲜花中多酚含量可看出，枸杞干花、鲜花多酚含量分别为1.49%、0.055%，均显示出较好的抗氧化性能，如果对其加以利用，可达到“变废为宝”的效果。

枸杞鲜花中的总多酚提取物具有较强的总抗氧化能力，枸杞鲜花总酚和总黄酮含量与其抗氧化活性呈显著正相关，因此，可将其作为抗氧化添加剂的一个重要来源，作为高抗氧化作用的食品或保健品进行开发。

（参考文献刊略，需者可函索zhangxin-weiyi8866@126.com）