镉胁迫下紫花苜蓿幼苗内源一氧化氮和活性氧的生成

2017-01-04蘧苗苗陈银萍苏向楠NGABIREMaurice柯昀琪MUKUNDWAAnneMarie

广西植物 2016年12期

关键词：叶中一氧化氮学报

蘧苗苗，陈银萍，苏向楠， NGABIRE Maurice，杨波，柯昀琪， MUKUNDWA Anne Marie

( 兰州交通大学环境与市政工程学院，兰州 730070 )

镉胁迫下紫花苜蓿幼苗内源一氧化氮和活性氧的生成

蘧苗苗，陈银萍*，苏向楠， NGABIRE Maurice，杨波，柯昀琪， MUKUNDWA Anne Marie

( 兰州交通大学环境与市政工程学院，兰州 730070 )

镉胁迫，紫花苜蓿，一氧化氮，活性氧

重金属由于其毒性大、难清除和可生物积累而受到广泛关注(Nath et al，2013；Chaudhuri et al，2014)。特别是近年来，随着全球人口快速膨胀、工农业生产迅速发展，重金属大量排放，从而严重影响了人类环境与社会可持续发展(Xu et al，2014)。据环保部与国土资源部联合公布的全国土壤污染公报显示，全国土壤点位超标率高达16.1%，其中以Cd污染最为严重，样点超标率达到7.0%，形势十分严峻(全国土壤污染状况调查公报，2014)。Cd在植物体内积累会刺激或抑制酶活性，影响组织蛋白质合成，抑制植物细胞分裂和伸长(廖柏寒等，2010)；抑制植物对水分的吸收和运输，抑制光合作用和呼吸作用，伤害细胞膜系统，阻碍植物生长(崔秀敏等，2011)；并通过食物链在人体内累积危害人的健康(Agrawal & Mishra，2009)。因此，研究Cd污染对植物生长发育的影响有重要意义。

苜蓿是世界范围内普遍种植的牧草植物，已有报道显示紫花苜蓿(Medicagosativa，alfalfa)具有清除土壤中高含量Cu、Zn等重金属的潜力(王文星等，2006；代惠萍等，2014)，是一种很有应用前景的土壤修复植物(孙宁骁，2015)，而环境中的Cd会影响紫花苜蓿的种子萌发、生长和幼苗的生理特性(孙园园等，2014；孙宁骁等，2015)。虽然已有研究表明适当浓度的外源NO可以增加渗透调节物质含量和调节抗氧化酶活性，缓解Cd 胁迫对紫花苜蓿幼苗的伤害(陈银萍等，2015)，但是目前关于Cd胁迫下紫花苜蓿内源NO和ROS的产生等报道却相对较少。基于上述认识，本研究以紫花苜蓿幼苗为材料，在水培条件下研究不同浓度Cd处理后紫花苜蓿幼苗根、茎和叶片内源NO和ROS以及膜脂过氧化作用变化的机制，旨在分析紫花苜蓿幼苗遭受Cd胁迫时的生理生态效应，以期为探索重金属Cd胁迫下紫花苜蓿的损伤、防卫机制的诱发等方面提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试紫花苜蓿品种为甘农三号 (MedicagoSativacv. Gannong No.3)，购自甘肃省农业科学研究院。测量NO含量和NOS活性的NO试剂盒和NOS试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。CD胁迫处理用CDCL2· 2.5 H2O(国药试剂)，其它试剂均为国产分析纯。

1.2 实验设计

1.3 测定方法

1.4 数据处理

采用STATISTICA和EXCEL软件进行数据处理和制图。不同处理组间的比较用单因素方差分析，多重比较采用Duncan新复方极差法(α=0.05)，相关性分析用逐步回归分析法。

2 结果与分析

2.1 Cd胁迫下幼苗NO含量及NO的产生途径

2.1.1 紫花苜蓿幼苗NO含量 Cd处理显著提高了紫花苜蓿幼苗根、茎和叶的NO含量(P<0.05)。0.5、1.0、0.25 mmol·L-1Cd处理分别使幼苗根、茎和叶中的NO含量达最大，与CK相比分别提高了142.63%、142.63%、119.53%(P<0.05)。随着Cd处理浓度进一步增大，幼苗根、茎和叶中NO含量呈急剧下降趋势。其中，根和叶的NO含量在显著下降之后仍能维持高于CK的水平(根：P<0.05；叶：P>0.05)；而2.0 mmol·L-1Cd处理使茎中的NO含量至最低，与CK相比下降了9.10%(P<0.05)。总体而言，同浓度Cd处理下，幼苗中NO含量为叶>茎>根，唯1.0 mmol·L-1Cd处理时为茎>叶>根(图1)。

图 1 Cd胁迫对紫花苜蓿幼苗根、茎和叶中NO含量的影响不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Fig. 1 Effects of Cd on the NO content in alfalfa seedlings (mean ± SE) Different small letters mean significant differences(P <0.05). The same below.

2.1.2 紫花苜蓿幼苗NO的产生途径 NOS是催化精氨酸形成NO的关键酶(邵小杰和杨洪强，2010)。在不同浓度Cd处理下，紫花苜蓿幼苗根、茎和叶中的NOS活性总体呈先升高后降低的趋势(P<0.05)。其中， 0.25、0.5和0.5 mmol·L-1Cd处理分别使得幼苗根、茎和叶中的NOS活性达最高，相比CK分别提高了46.68%、137.78%和1495.93%(P<0.05)。相对地， 2.0 mmol·L-1Cd处理使得幼苗根和叶中的NOS活性至最低，相比CK分别降低了81.4%和20.26%(P<0.05)；而1.5 mmol·L-1Cd处理使茎中的NOS活性较最高值虽已显著降低，但仍比CK高42.12%(P<0.05)。另外，低浓度Cd处理下幼苗NOS活性为根>茎>叶；而高浓度Cd处理下幼苗NOS活性为茎>根>叶(图2:A)。

NR能以NADH作为电子供体，催化NO2-的单电子还原合成NO(田华等，2009)。在不同浓度Cd胁迫下，紫花苜蓿幼苗的根、茎和叶中NR活性总体呈先升高后降低的趋势。其中，0.125、0.5和0.5 mmol·L-1Cd处理分别使幼苗根、茎和叶中的NR活性达到最高，相比CK分别提高了24.47%、35.64%和149.53%(P<0.05)。相对地， 2.0 mmol·L-1Cd处理使幼苗根、茎和叶中的NR活性分别降至最低，相比CK分别降低了10.67%(P<0.05)、28.30%(P<0.05)和8.44%(P>0.05)。此外，紫花苜蓿幼苗NR活性为叶>茎>根；同浓度Cd处理下，幼苗NR活性的变化幅度也是叶>茎>根(图2:B)。

在酸性还原性条件下，植物组织中NO2-可通过发生还原反应产生NO(徐茂军，2009)。不同浓度Cd处理下，紫花苜蓿幼苗根、茎和叶中的NO2-含量总体也是呈先增大后减小的趋势。其中， 0.125、 0.25和0.125 mmol·L-1Cd处理分别使得幼苗根、茎和叶中的NO2-含量达最大，相比CK分别提高了36.11%、16.77%和222.81%(P<0.05)。相对地， 1.5和2.0 mmol·L-1Cd处理分别使得幼苗根和茎中的NO2-含量至最小，相比CK分别降低了66.67%和24.07%(P<0.05)；而2.0 mmol·L-1Cd处理虽使得幼苗叶中NO2-含量较最大值已显著降低，但仍比CK增加了19.30%(P<0.05)。此外还可看出，幼苗NO2-含量为叶>茎>根；同浓度Cd处理下，幼苗NO2-含量的变化幅度为叶>根>茎(图2:C)。

光介导的Car可将NO2转化成NO(张洪艳等，2009)。Cd处理使幼苗茎和叶中的Car含量发生了显著变化(P<0.05)。其中， 1.5 mmol·L-1Cd处理使茎中Car含量达到最大，较CK增加了293.94%(P<0.05)；而在2.0 mmol·L-1Cd处理下，Car含量较最大值急剧降低，但仍比CK高9.09%(P>0.05)。相似地， 0. 25 mmol·L-1Cd处理显著提高了幼苗叶中的Car含量，与CK相比增加了13.17%(P<0.05)；但随着Cd处理浓度的进一步增大，叶中Car含量急剧下降，在2.0 mmol·L-1时达到最低，相比CK降低了62.55%(P<0.05)。此外，紫花苜蓿幼苗Car含量总体为叶>茎；同浓度Cd处理下，幼苗Car含量的变化幅度则是茎>叶(图2:D)。

图 2 Cd胁迫对紫花苜蓿幼苗NOS活性(A)、NR活性(B)、NO2-含量(C)和Car含量(D)的影响Fig. 2 Effects of Cd on NOS activity (A)，NR activity (B)，NO2- content (C) and Car content (D) in alfalfa seedlings

图 3 Cd胁迫对紫花苜蓿幼苗H2O2含量(A)、MDA含量含量(C)和REC(D)的影响Fig.

2.2 Cd胁迫下幼苗根、茎和叶中ROS的生成

H2O2是植物细胞代谢过程中产生的一种活性氧。不同浓度的Cd处理显著提高了紫花苜蓿幼苗体内的H2O2含量(P<0.05)。其中， 2.0、0.5和1.0 mmol·L-1Cd处理使幼苗根、茎和叶中的H2O2含量分别达到了最大值，相比CK分别增加了139.13%、121.21%和122.22%(P<0.05)(图3:A)。

MDA是植物膜脂过氧化的主要产物，其含量直接反映细胞损伤程度(刘周莉等，2009)。不同浓度的Cd处理显著提高了紫花苜蓿幼苗体内的MDA含量(P<0.05)。其中1.5 mmol·L-1Cd处理使幼苗根和茎中的MDA含量均分别达到了最大值，相比于CK分别增加了117.06%和318.35%(P<0.05)。幼苗叶中MDA含量的最大值在Cd处理浓度为2.0 mmol·L-1时出现，相比于CK增加了732.57%(P<0.05)，升值幅度明显高于根和茎(图3:B)。

REC可以用来表示电解质渗透率的变化，而电解质渗透率的变化可直接反映出细胞膜透性的改变以及细胞被破坏情况(陈钰等，2007)。不同浓度的Cd处理显著提高了紫花苜蓿幼苗体内的REC(P<0.05)。其中，1.0 mmol·L-1Cd处理使幼苗根和茎中的REC分别达到了最大值，相比于CK分别增加了72.33%和73.19%(P<0.05)。幼苗叶中REC随着Cd处理浓度的增加而持续升高，在2.0 mmol·L-1时达最大，相比于CK增加了210.28%(P<0.05)。此外，幼苗的REC为根>茎>叶，而升值幅度则是叶显著高于根和茎(P<0.05)(图3:D)。

2.3 Cd胁迫对幼苗根系活力的影响

根系活力是评价植物根系的吸收、合成、氧化和还原等能力的一项生理指标，可客观地反映植株生命代谢活动(何俊瑜等，2009)。随着Cd处理浓度的增加，紫花苜蓿幼苗根系活力呈明显的先增强后减弱趋势(P<0.05)，低浓度Cd处理使根系活力增强，0.25 mmol·L-1处理使根系活力达最强，相比CK增加了36.94%(P<0.05)。高浓度Cd处理使根系活力减弱，2.0 mmol·L-1Cd处理下，根系活力仅为CK的55.42%(P<0.05)(图4)。

图 4 Cd胁迫对紫花苜蓿幼苗根系活力的影响Fig. 4 Effects of Cd on root activity in alfalfa seedlings

2.4 Cd胁迫下幼苗内源NO和ROS生成的相关性及逐步回归分析

根中NO含量与NOS、NR及NO2-正相关(P>0.05)，表明NOS、NR和NO2-在根内NO生成过程中起作用。茎中NO含量与NOS、NR极显著正相关(P<0.001)，说明NOS、NR是影响幼苗茎中NO含量的主要因素；与NO2-、Car正相关，说明NO2-、Car促进了茎中NO的生成。而叶中NO含量与NOS极显著正相关(P<0.001)，与NO2-较显著正相关(P<0.01)，与NR显著正相关 (P<0.05)，与Car正相关，说明NOS、NO2-和NR则是影响叶中NO含量的主要因素。逐步回归分析结果如下。

根：Y=375.333+11.756X1+254.14X3

r1=0.41730,r3=0.39904

茎：Y=187.997+35.700X1+17.050X2

r1=0.67443,r2=0.82804

叶：Y=818.423+43.62X1+3.019X2+129.415X3

r1=0.41730,r2=0.17874,r3=0.39904

式中，Y为NO含量，X1为NOS，X2为NR，X3为NO2-，r为相关系数。逐步回归分析与相关性分析结果相同(表1)。

根：Y=428.608+7.815X1+11.405X3

r1=0.23040,r3=0.34069

茎：Y=493.098+16.939X1+42.875X3

r1=0.45058,r3=0.54518

叶：Y=1366.775-19.715X2+14.538X3-6.030X4

r2=-0.3719,r3=0.28211,r4=-0.4125

3 讨论

NO广泛参与了植物对逆境胁迫的响应，而响应特征可由内源NO含量的变化规律反映(陈娟等，2009)。本研究结果显示低浓度的Cd处理使紫花苜蓿幼苗根、茎和叶中的NO含量显著升高，说明此时NO正充当活跃的信号分子引发相关生理反应以保护植物(邵小杰和杨洪强， 2010)。已有研究表明高浓度Cd会显著降低植株中NO产生量(林啸等，2014；邵小杰和杨洪强， 2010)，但在本研究中，高浓度的Cd处理下幼苗中的NO含量虽逐渐降低，但仍维持略高或持平于CK的水平，这也可能是由于Cd的积累破坏了NO清除机制(Barroso et al，2006)，类似的变化在大麦幼苗中也曾出现(陈娟等，2009)。

NO的产生主要可分以为酶促和非酶促反应(Beligni & Lamattina，2000)。NOS和NR是酶促反应的关键酶。逐步回归分析显示，NOS和NR是影响茎中NO含量的主要因素；NOS、NO2-和NR则是影响叶中NO含量的主要因素，而根中NO含量主要与NOS活性和NO2-含量有较大的相关性。NR催化合成NO需要在较高的NO2-条件下进行(Morot-Gaudry-Talarmain et al，2002)；而本研究结果表明，NR活性的升高都在NO2-含量增加之后，这也符合NR途径作用产生NO的规律。当Cd浓度达到0.5 mmol·L-1时，Car含量突然下降，下降趋势较陡，说明浓度高于0.5 mmol·L-1的Cd处理对紫花苜蓿幼苗有明显损伤，对NO的合成作用也较弱；而茎中Car含量走势相对较为平缓，说明Cd胁迫对茎中Car含量的影响不显著。整体而言，Cd胁迫会极大地抑制Car的合成，这与翟晶(2013)对杨树幼苗的研究结果相一致。

表 1 Cd胁迫下紫花苜蓿幼苗内源一氧化氮和活性氧生成的相关性

注： * 表示不同指标间相关性显著(P<0.05)，**表示不同指标间相关性较显著(P<0.01)，***表示不同指标间相关性极显著(P<0.001)。

Note:*, **, and *** indicate significant differences atP<0.05,P<0.01 andP<0.001, respectively.

本研究结果表明，低浓度Cd胁迫在加剧紫花苜蓿幼苗膜脂过氧化的同时，也促进了根系活力的提高，说明此时幼苗代谢旺盛，这也可能是植物的一种应激反应。低浓度的Cd可以刺激细胞抗性蛋白的产生和激活抗氧化系统，加速一些生理生化反应(邵小杰和杨洪强， 2010)。但高浓度的Cd会造成ROS的产生与清除能力失衡，造成自由基的大量累积，从而引发植株膜脂过氧化作用(慈敦伟等，2009)。逐步回归分析的结果表明，根系活力与ROS生成的各指标基本呈现负相关，表明高浓度的Cd处理使得ROS生成的各指标急剧上升，而根系活力却持续下降，也证明了此时细胞已受严重伤害。

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Effects of endogenous NO and ROS generation in alfalfa under Cd stress

QU Miao-Miao, CHEN Yin-Ping*, SU Xiang-Nan, NGABIRE Maurice,YANG Bo, KE Yun-Qi, MUKUNDWA Anne Marie

( School of Environmental and Municipal Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, China )