贾根来 成翔 朱学芳 张鹏 陈长兵

层粘连蛋白配体及其受体在大鼠星形细胞及挫伤脑细胞中表达差异

贾根来 成翔 朱学芳 张鹏 陈长兵

目的观察层粘连蛋白配体（LN）与层粘连蛋白受体（LN-R）mRNA在大鼠星形细胞（Astrocyte）和挫伤脑细胞（Cell of TBI）之间表达的差异，探讨术中是否应尽量保存脑组织。方法从SD大鼠大脑皮层中培养星形胶质细胞，同时培养脑挫伤细胞（取自SD大鼠挫伤脑组织）。分别提取细胞总RNA，采用RT-PCR方法，分析LN和LN-R mRNA在大鼠星形细胞和挫伤脑细胞中表达的差异。结果RT-PCT检测，大鼠星形细胞组和挫伤细胞组中均表达LN与LN-R mRNA，而挫伤脑细胞组中表达的LN和LN-R mRNA明显上升，差异有统计学意义。结论 大鼠星形细胞和挫伤脑细胞中LN及LN-R表达存在明显差异，考虑与诱导神经干细胞迁移和分化等有关。重型颅脑外伤手术中，在无明显出血的情况下，应尽量保留挫伤脑组织。

层粘连蛋白配体 层粘连蛋白受体 星形胶质细胞 挫伤脑细胞

本系列课题已做的细胞迁移实验中，作者证实LN配体及其受体表达升高，可能与诱导神经干细胞的迁移有关［1］。2013年8月至2015年5月作者通过实验研究，观察LN配体及其受体在大鼠脑挫伤细胞中是否表达上调，并在RNA水平进行验证。

1 材料与方法

1.1 细胞的培养及鉴定 （1）星形胶质细胞的培养及鉴定：选用成熟SD大鼠，夹取大脑皮层组织约50mg，放入CMF-Hanks液中洗涤、静置，用0.125%的胰蛋白酶液消化并吹打；15%小牛血清DMEM/F12培养基终止消化，离心后孵育。待细胞贴壁后，加入4%多聚甲醛1ml固定30min，0.01M PBS洗涤3次，每次10min。含10%羊血清、0.3% Triton-100的0.01M PBS液在37℃条件下孵育封闭10min。加一抗（小鼠抗GFAP IgG1，按1：500倍稀释），放入4℃冰箱过夜，洗去一抗，用0.01M PBS洗涤3次，10min/次。加入二抗（FITC标记的羊抗小鼠IgG，按1：200倍稀释），避光，在37℃水浴箱内孵育30min，吸去二抗，洗涤3次，10min/次。在激发光波长为490nm，滤色光波长为520nm的共聚焦显微镜下观察照相。（2）大鼠挫伤脑细胞的培养与传代：采用美国AmScien Instruments公司FP302型颅脑液压损伤装置，参照颅脑液压损伤（FPI）模型制备方法，造成大鼠左侧颅脑损伤。冲击后损伤皮质均立即出现明显血肿，表明模型制备成功。取大鼠挫伤脑细胞，用含20%小牛血清的DMEM/F12培养基培养4～6d，隔日换液1次。待细胞生长处于对数期时分别接种在2个培养瓶中继续培养。传代后的大鼠挫伤细胞用作提取蛋白。

1.2 RT-PCR（1）大鼠星形胶质细胞和挫伤脑细胞RNA的提取：各取1×107的大鼠星形胶质细胞和挫伤脑细胞至1.5ml微量离心管中，加入1ml Trizol试剂裂解，再加入氯仿200μl并振荡15s，静置2min。4℃离心，12000r/min，离心15min。将上层水相吸出，加异丙醇500μl。静置10min。4℃离心，12000r/min，离心10min。弃上清液后加75%乙醇1ml洗涤沉淀。4℃离心，7000r/min，离心5min。弃净上清液，室温晾干沉淀。加入20μl RNase-free ddH2O，65℃水浴助溶15min。（2）紫外吸收法测定总RNA定量：采用紫外分光光度法测定RNA含量并鉴定RNA纯度，RNA浓度计算公式为：RNA（mg/ml）=40×OD读数×稀释倍数（n）/1000。（3）逆转录反应（第一链cDNA合成）：操作步骤：在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 2μg，然后依次加入下列试剂：2.0μl 10mol/L Oligo dT15；10×PCR buffer 2.0μl；2.0μl 5mmol/L dNTPmix；Reverse Transcriptase 1.0μl（4U/μl）。加入适量的DEPC-treated H2O使总体积为20μl。轻柔混匀，37℃孵育60min。④于70℃加热15min以终止反应。⑤将管插入冰中，加入TE 40μl，轻柔混匀，稍离心。（4）引物设定：本实验所用PCR引物采用在线软件Primer 3.0，由上海博亚公司合成。引物名称、序列见表1。

表1 引物名称、序列

（5）扩增LN配体 及其受体：在0.2ml PCR专用Ep管中进行，在冰上依次加入下列试剂：2μl cDNA范本、2.5μl 10×PCR buffer、1.5μlMgCl2、1.0μl dNTPmix（2mmol/L）、0.5μl［Lama1上游引物（10μmol/L）、0.5μl Lama1 下游引物 （10μmol/L）］/［Rpsa上游引物（10μmol/L）、0.5μl Rpsa下游引物 （10μmol/L）］、0.5μl Taq酶（2U/μl）、16.5μl ddH2O，最后补至20μl；设置内参组（GAPDH）片段的PCR扩增条件为：大鼠脊髓总RNA RT产物（第一链）1μl，10×PCR Buffer 2.5μl；MgCl2（25mmol/L）2.0μl；dNTPmix（2mmol/ L）2μl；GAPDH上游引物、下游引物各1μl（10μmol/ L）；Taq DNA聚合酶0.3μl；ddH2O 16.2μl；总体积25μl；温和混匀后离心。94℃，预变性5min；94℃，变性30s；56℃，退火30s；72℃，延伸40s。循环26次。最后72℃延伸7min。（6）PCR产物琼脂糖凝胶电泳：在扩增DNA的Ep管中，每管取5μl，加入6×loading buf 1μl，混匀，离心，加入载样孔，行1.5%琼脂糖凝胶100V电泳约15min，检测PCR产物。紫外灯下观察并记录结果。

1.3 统计学方法 以目的基因mRNA和内参GAPDH mRNA含量的比值作为评价指标，反复实验3次。采用PD Quest软件对凝胶图像进行分析，采用stata 10.0统计分析软件，对大鼠星形胶质细胞和挫伤脑细胞相应RT-PCR电泳条带相对吸光度值进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 星形胶质细胞培养和GFAP免疫荧光检测 见图1、2。

2.2 总RNA的检测 大鼠星形胶质细胞与挫伤脑细胞总RNA经甲醛变性胶电泳、EB染色，28S和18S条带清晰可见，5S条带隐约可见，提示RNA未降解。OD260/OD280为1.90，表明RNA纯度满意。见图3。

2.3 LN 及其受体表达电泳 分别将大鼠星形胶质细胞和挫伤脑细胞总RNA经甲醛变性胶电泳、EB染色，GAPDH为对照，可见挫伤脑细胞中LN配体及其受体表达较星形胶质细胞明显增加。见图4。

2.4 LN及其受体表达变化分析 将RT-PCR电泳OD相对值（目的基因OD值/内参OD值）进行统计学分析，发现挫伤脑细胞LN配体及其受体表达量与星形胶质细胞比较，差异有统计学意义。见图5、6。

图1 从SD大鼠大脑皮层中分离、培养的星形胶质细胞GFAP-FITC，Common Focus （Bar=50μm）

图2 实验中培养的大鼠挫伤脑细胞（Bar=50μm）

图3 总RNA电泳图

图4 LN及其受体表达电泳

图5 LN配体表达变化分析

图6 LN受体表达变化分析

3 讨论

Ajioka I等［2］通过研究发现，LN是最有利于人NSC迁移的底物。Flanagan等［3］通过活体外NSC在四种不同的底物（多聚-L-鸟氨酸，纤维连接蛋白，层粘连蛋白，基质胶）上的迁移，以及其不同反应，观察到LN能加强NSC的迁移，分化，延长细胞的存活时间。表明LN及其integrin受体是人类NSC重要的调节因子。Tate［4］通过腹前脑生殖区分离神经节隆起祖细胞（geNPC），成人纹状体祖细胞，并做体外培养，分析在不同ECM底物上的粘附、迁移和分化能力。发现，geNPC在LN上，其粘附和迁移能力明显加强。

重型脑外伤患者，特别是对冲性脑挫裂伤手术患者，可能在术后出现迟发性血肿。部分血肿较大，甚至形成脑疝，危及生命，影响患者的预后，需再次手术治疗［5］，有时会造成医患矛盾。多数认为，再次出血的原因较多，医源性的因素是包括初次手术止血不严格，也可能与脑挫伤失活组织再次渗血相关［6］。有学者认为，挫伤脑组织完全失活，无组织学活性。且可能成为术后再出血的根源，引发医患矛盾。因此，手术中，应将挫伤脑组织完全清除［7］。但术中挫伤脑组织清除过多，即使是部分“功能哑区”组织清除，也可能对患者的预后形成影响。加大痴呆，癫痫，昏迷等并发症的发生几率［8-9］。

在本实验中，作者提取大鼠星形胶质细胞和挫伤脑细胞的总RNA进行RT-PCR反应，证实挫伤脑细胞表达高水平的LN及LN-R。结合以往实验的结论，建议重型颅脑外伤的手术中，在无明显活动性出血的情况下，应该尽量保留挫伤脑组织，避免过度清除挫伤的脑组织。

［1］高宜录,张鹏,刘梅. 层粘连蛋白受体与配体在C6胶质瘤细胞中的表达及意义.苏州大学学报(医学版),2007,27(6)：844-847.

［2］Ajioka I,Jinnou H,Okada K,et al. Enhancement of neuroblast migration into the injured cerebral cortex using laminin-containing porous sponge. Tissue Eng Part A,2015,21(1-2)：193-201.

［3］Flanagan LA, Rebaza LM, Derzic S, et al. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J Neurosci Res,2006, 83(5)： 845-56.

［4］Tate MC, Garcia AJ, Keselowsky BG, et al. Specific bet al integrins mediate adhesion, migration, and differentiation of neural progenitors derived from the embryonic striatum. Mol Cell Neurosci, 2004,27(1)： 22-31.

［5］陆健,利文倩,黄国洲,等. 重型颅脑损伤二次手术原因及效果分析. 中国临床新医学,2010,9(3)：848-850.

［6］董建平,罗志伟,王和平,等. 神经外科开颅术后再次手术26例临床分析. 昆明医学院报,2011,12(9)：127-128.

［7］陈西亚,黄金生,陈文培,等.急诊颅脑损伤术后二次手术原因与对策(附21例临床分析).世界最新医学信息文摘,2013,13(23)：29-30.

［8］陈伟朝,李少鹏,韩伟英. 颅脑外伤术后癫痫的预防. 中国当代医药,2012,19(10)：44-45.

［9］李晨,郎森阳,刘学文.颅脑外科手术前后继发性癫痫186例临床分析.解放军医学杂志,2009,34(3)：329-332.

ObjectiveTo investigate the mRNA differential expression of Laminin （LN） and its receptor LN-R between rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI and explore the necessity of preservation of brain tissue around the injured cortex on operation. Method Isolated and cultured rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI respectively. Total RNA was extracted. Semi-quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR） method was used in detection of the expression change of LN and LN-R between rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI.ResultsLN and LN-R mRNA were expressed in rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI. The mRNA expression level of LN and LN-R of rat cells around the injured cortex area after TBI were higher than these of rat astrocytes，the difference was signifi cant，P＜0.05.ConclusionLN and LN-R differentially expressed in rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI. We speculated this phenomenon was involved in biological process of the migration and differentiation of neural stem cells. During the operation of severe craniocerebral trauma，in the absence of obvious hemorrhage，brain tissue should be reserved as much as possible.

Laminin Laminin receptor Astrocytes Cells of traumatic brain injury

2014年江苏省如皋市科技局科技立项课题(HS149130)

226500 江苏省如皋市人民医院（贾根来 朱学芳 张鹏 陈长兵）

226001 南通大学医学院解剖实验室（成翔）