朱思荣，周万里，毕春元，张利群，杨艳，张金玲，赵晓华

(山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250014)



【生物传感器】

基于生物传感器的发酵过程在线分析系统研制

朱思荣，周万里，毕春元，张利群，杨艳，张金玲，赵晓华

(山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250014)

基于发酵过程自动优化控制的需求，研制了发酵过程生物传感器在线自动取样分析系统。给出了在线分析系统的分析原理及其结构组成，详细介绍了自动取样、样品稀释及生物传感器信号处理的方法。系统可以实现对葡萄糖、乳酸和谷氨酸等重要生化参数的自动取样分析，并把分析结果通过485接口或4～20 mA模拟接口发送到发酵控制器，为发酵控制提供生化分析数据。用葡萄糖标准样品作为发酵液对实验样机进行了测试，结果表明在线分析系统具有较高的分析精度，可以满足发酵过程分析的需求。

生物传感器；自动分析仪；在线分析；葡萄糖分析；乳酸分析；发酵罐自动取样

在微生物发酵工艺过程中，反应物质的浓度是发酵控制决策的重要依据[1]，要实现发酵过程自动优化控制必需对一些重要生化参数实现在线分析。多年来在生化参数的在线自动分析上已有不少研究[2-10]，但至今国内未见有成熟的产品。鉴于生化参数检测对发酵控制的重要意义，国外的一些生化分析仪厂商为全自动生化分析仪提供了在线自动取样模块，用于发酵过程分析。如Nova的Bioprofile系列[11]、YSI的2700系列[12-13]生化分析仪均可配备在线取样模块，快速分析发酵过程生化参数。美国Flownamics公司研发了一款专用于发酵罐内取样的自动取样系统SEGFLOW 4800[14]，可以与YSI和Nova公司的生化分析仪及Waters Acquity超高效液相色谱联机，从发酵罐内获取样品，经稀释处理后提供给生化分析仪或高效色谱分析仪，并从后者获得分析结果，系统可以与数款监控和数据采集平台(SCADA)软件实现数据通讯，从而获得在线分析系统的效果。

基于国内发酵过程在线分析的现状，我们将在线取样控制、样品的稀释处理和生化参数分析系统进行整体设计，研制了基于生物传感器的发酵过程在线自动分析系统。系统可以安装3个酶电极生物传感器，每次取样最多可以测定3个生化指标，分析测定结果能够以4～20 mA模拟量或串口数据方式发送到发酵控制系统，为发酵过程的优化控制提供生化参数数据。

1 分析原理

生化参数的检测采用酶电极生物传感器方法，酶电极是由过氧化氢电极表面紧贴安装固定化酶膜组成。结构如图1所示。

图1 固定化酶膜剖面图Fig.1 Sectional view of immobilized enzyme membrane

固定化酶膜是一个三层膜结构，粘接在一个支撑橡胶圈上。紧贴电极为内膜层，仅允许H2O2等小分子通过，用于排除一些分子量较大的氧化还原物质对电极信号的干扰。内膜之外为固定化酶层，是传感器的信号源，由待测底物的氧化酶经戊二醛交联固定制成。固定化酶膜的最外层为支撑膜，膜孔径在10 μm以下，可以自由透过待测物。待测定底物在固定化酶层经底物氧化酶催化，产生过氧化氢。反应如下：

式中底物为待测定物，如底物为葡萄糖或L-乳酸，相应的底物氧化酶就是葡萄糖氧化酶或L-乳酸氧化酶，产物为葡萄糖酸或丙酮酸。

酶反应生成H2O2的速度与底物浓度符合酶反应的米氏公式，在一定的底物浓度内可以视为线性关系。在测定系统中，因为酶反应为电极表面的局部反应，生成的H2O2在电极表面还原，形成电极电流，反应池中H2O2浓度极低，所以可以在反应池中放置多个电极，同时测定多个生化参数而不会互相干扰。

H2O2电极把酶反应生成的H2O2转换为电极电流，电极电流与H2O2的浓度成正比，而H2O2的浓度与酶反应的底物浓度成正比，所以电极电流与电极上的待测物浓度成正比关系。酶是一种有催化活性的蛋白质，酶的催化活性与本身结构、环境温度和pH等因素有关，在环境不变的条件下，酶活在一定时间内可以看作稳定不变，用标准样品对传感器进行标定可以获得待测物浓度与电极电流的比例关系，根据这个关系和测定时的响应电流即可计算出待测物的实际浓度。

2 分析系统设计

在线分析系统从发酵罐内采集发酵样品，再把样品进行稀释处理，使样品能在测定过程中获得最佳分析精度，再根据测定结果和稀释状态计算出发酵原液中待测物含量，最终把分析结果通过数据接口输出到发酵控制系统，为发酵控制器提供生化参数数据。整个系统的组成如图2所示：

图2 在线分析系统结构图Fig.2 Structure diagram of online analysis system

2.1 在线自动取样设计

由于发酵罐种类多，大小差异极大，对取样系统也要求不一，小罐要求取样量要少，大罐更强调取样要安全可靠。为保证在线分析系统的通用性，本系统设计支持从发酵罐内直接取样和先把样品放到U型管内暂存，再从U型管内取样两种方式。前者取样量少，适用于小型发酵罐；后者模拟手动取样流程，取样量较多，但安全性和可靠性均较高，适合大型发酵罐使用。因为分析系统与发酵罐之间有一定的距离，所以把取样器分为罐旁控制装置和仪器端控制装置两部分，在线分析系统通过连接电缆控制罐旁控制装置上的泵和阀。图3为罐内直接取样示意图，图4是U形管间接取样示意图，中间虚线表示连接罐旁控制装置和仪器端控制装置的硅胶取样软管。

采用直接取样方式，可以选用陶瓷膜过滤式取样器[15]从发酵罐内取样，也可以通过直管直接从发酵罐内取样。前者因为陶瓷膜的孔径能阻挡细菌通过，安全性高，但也容易因为过滤器阻塞导致取样失败；后者因为取样管与发酵罐直接相通，对操作要求较高，取样管在发酵前必需彻底灭菌，吹气必须使用无菌空气，对于长时间发酵最好定时对取样管路进行化学灭菌处理。

图3 发酵罐内直接取样示意图Fig.3 Illustration of direct sampling in fermentation tank

图4 U型管间接取样示意图Fig.4 Illustration of indirect sampling with U-type tube

取样时先开启取样泵、管路阀和取样阀，样品经取样器，通过取样阀和管路阀流向样品池，当管路的液体传感器检测到样品后，延时一定时间，控制取样量，然后关闭取样阀，开启吹气泵和吹气阀，由无菌空气推送管路内的样品到达样品池。当样品池的液位传感器检测到样品后关闭取样泵，开启废液阀，把管路内多余样品排放到废液瓶内，完成一次取样。样品池样品可以通过开启废液阀和反转取样泵排入废液瓶。在线分析系统对样品的需求量小于1 mL，在取样周期较长时，为了去除上次取样管壁残留样品对分析测定的影响，通常需要取样2～3次。前几次取样用于清洗管路和样品池，最后一次取样用于分析测定。

图3左侧所示消毒清洗液接口，用于手动对取样管路进行化学灭菌，取样阀和吹气阀都是带常开和常闭的双路压管阀，在取样阀吹气阀均关闭时，手动开启管路阀和取样泵即可吸取消毒清洗液填充取样管，对取样管路进行化学灭菌处理。图3右侧的消毒清洗液用于封堵取样管路，在直管直接罐内取样状态下，最后一次取样完成后，开启取样泵和清洗液阀数秒，让消毒清洗液进入管路内，可以防止环境杂菌通过样品池污染取样管。

间接取样方式通过预取样，先把样品保存在一段U型管内，然后从U型管的底部取样，后续取样过程同直接取样。在取样完成后通过开启蒸汽阀完成对U型管的排液和灭菌，取样安全性高， 发酵样品在U型管内，还能排除发酵液中的气泡。这种方式一次取样量大，通常为100 mL以上。

2.2 样品稀释方法

发酵样品通常需要经过稀释处理才能分析测定，对于高糖发酵，通常要有200倍以上的稀释才能保证正常分析。样品稀释通过高精度注射泵配合二维移动的进样针和样品稀释池实现，图1结构图中的样品池、标样池、稀释池和生物传感器反应池呈直线排列，二维定位取样针能移动到这些液体池内吸取或释放样品。稀释过程先在样品池中吸取一定量的样品，再在稀释池中放出样品和缓冲液。通过调整取样量和放液总量来调整稀释倍数，样品注入反应池的测定过程也是一个稀释过程，为简化设计，我们把2倍和5倍稀释放在反应池池内，通过控制进样量为标准进样量的1/2和1/5实现。在稀释池内实现10倍、20倍和50倍稀释。总稀释最高可达250倍，可以满足生物传感器对高浓度样品测定的需求。

本设计中注射泵总容量为1 mL，生物传感器的进样量40 μL左右，进样过程实现5倍稀释时进样量仅为8 μL左右，为保证测定的重复性，注射泵每次取样时定位在一个固定位置。由于进样量少，注射泵的非线性、进样针壁的残液以及进样针口的扩散等因素对稀释有较大的影响。表1是按理论进样量重复测定标准样品的检测结果，不稀释进样量为200步(0.208 333 微升/步)，2倍稀释进样量100步，5倍稀释进样量40步，5倍稀释的测定结果显著偏高。我们通过对3个稀释比例的进样量进行微调，降低了因注射泵非线性等因素带来的误差。表2是微调进样量后的重复10次测定结果，不稀释进样量为218步，2倍稀释进样量108步，5倍稀释进样量40步。

表1 按理论进样量测定葡萄糖标准样品结果Table 1 Determination results of standard glucose based on theoretical sample volume

表2 按补偿进样量测定葡萄糖标准样品结果Table 2 Determination results of standard glucose based on compensation sample volume

在稀释池内稀释的精度与高精度注射泵的取样和放样精度有关，也与样品稀释池的残液有关，上一样品测定完成，样品池清洗后会留下一定量的残液，最好的办法是对稀释池进行干燥处理，但这会增加系统的复杂程度，也要增加分析处理的时间，我们通过合理的设计，把稀释误差控制在允许的范围内。首先把对稀释池的清洗设置在每次稀释之前，减少稀释池残留水份挥发不一造成的误差；其次在稀释池内涂疏水膜，尽量减少残留水量；最后稀释池的搅拌混匀采用空气气泡搅拌，去除搅拌捧对残留水的影响。经以上处理，样品稀释具有较好的重复性，表3是浓度为10、20和50 g/L的标准葡萄糖样品经10倍、20倍和50倍稀释后的重复10次测定结果。

表3 稀释池不同稀释倍数测定结果Table 3 Determination results of different dilution in diluted pool

2.3 酶电极反应池

生物传感器分析核心部件为安装酶电极的反应池系统，基本结构如图5所示。

图5 酶电极反应池系统Fig. 5 Reaction cell system of enzyme electrode

为减少蠕动泵数量，反应池仅安装排空泵，双泵管结构，用于排除反池腔和溢流腔内的废液，反应腔清洗过程缓冲液由注射泵通过进样针注入。反应池溢流帽限制反应腔的容积为一固定的体积，清洗过程多余的缓冲液通过溢流帽排入溢流腔内，定量样品注入反应腔内，稀释倍数固定不变。反应腔内的搅拌子用于快速混匀分析样品。每次测定后开启排空泵，排除反应腔和溢流腔内的废液，然后用新鲜缓冲液注满反应腔，等待下次测定。在反应池侧面可安装1～3个酶电极生物传感器，分别测定1～3个分析目标。

2.4 生物传感器信号处理

生物传感器的信号采样方式采用二点法分析，在进样前等待酶电极信号电流稳定，进样时记录电极的零点电流值，当达到设定的反应时间后记录即时电极电流，二者的差值即为酶电极对测定样品的响应电流。生物传感器具有较快的样品响应速度，通常20 s即可达到最大响应值的90%以上，采用二点法进行分析，因为测定结束时接近反应终点，可以获得较高的测定精度。

酶生物传感器分析测定是在酶催化活性稳定状态下，通过对比待测样品与标准样品在同一电极上的响应电流实现。用标样标定时根据标样浓度和响应电流，计算出单位响应电流的样品浓度，即标定系数，在测定样品时，根据样品的响应电流和标定系数，计算出样品浓度。由于酶的催化活性会随时间和环境温度而改变，而发酵过程在线分析间隔时间需要根据发酵状态和要求调整，通常为20～60 min，所以在每次分析前需先对酶催化活性用标准样品进行标定，整个标定过程也是酶活性的稳定过程。

酶电极传感器在使用一定时间后，对于底物的响应有可能偏离线性关系,对传感器作线性校正可以延长传感器的使用寿命。实测数据表明酶电极经标定后测得的底物浓度，其结果与底物实际浓度的关系基本符合酶反应的米氏方程：

3.3.1 积极营造适合中职生学习的课堂环境 良好的环境对心理调节和行为规范有积极作用，包括物质环境和心理环境。物质环境：主要是指教室布置。应按照专业特点合理规划，设计与专业有关的内容，保持教室的整洁，从而增强学生的责任感。心理环境：和谐的课堂氛围对于学生良好行为习惯的养成具有重要影响。课堂气氛和谐融洽，教师讲课心情愉悦，学生就容易受到感染，不仅课堂问题行为很少，还能促进其学习与交流。

Y=aX/(b+X) ，

(1)

式中,a和b为校正系数，X表示实际底物浓度，Y为测定底物浓度。在标样浓度范围内，1/2标样浓度时具有最大偏差值。所以在设计中以2倍稀释标样对传感器进行线性校正。根据(1)式，在定标点测定浓度与实际浓度一致，即X=Y=V(V为标样浓度)，代入(1)得：

V=aV/(b+V) 。

(2)

在校线性点，X=0.5V，Y=VL(L为校线性点测定结果)，代入(1)得：

VL=0.5aV/(b+0.5V) 。

(3)

从式(2)和式(3)可求出线性校正系数a和b，完成线性校正。

从式(1)变换得：

X=bY/(a-Y) 。

(4)

在分析过程中，标定完成后再根据式(4)求出实际底物浓度。传感器的线性变化缓慢，线性校正操作每隔1～2 d做一次即可。

2.5 在线分析自动稀释处理

生物传感器分析的样品分析精度与样品的浓度有关，当样品浓度接近标准样时具有最高的分析精度，过高浓度的样品超出传感器的检测范围，并可能影响传感器的性能，而浓度太低会增加测定误差，所以合适的样品稀释也是提高分析精度的重要手段。在某些发酵中，因为干扰物质的存在，必须对样品进行一定的稀释才能获得较高的分析精度。为解决上述问题，本设计中加入了最低稀释倍数限定和稀释倍数自适应，当稀释后测定结果超过标样浓度1.5倍，则自动增加一级稀释，重新测定，当测定结果低于标样浓度的40%，如当前稀释大于最低稀释的限制，则减少一级稀释，重新测定。如果有多个生物传感器，稀释以浓度最高的检测对象作为自动调整的判断基准。样品测定完成后把结果乘以测定时的稀释倍数，得到实际样品浓度。

在线分析系统的目标是为发酵过程控制提供生化参数数据，便于发酵控制系统根据生化参数检测结果对生物发酵过程进行调控。为适合不同控制系统的要求，在线分析系统在设计中使用3种接口方式：(1)通过485总线，以专用指令从系统的结果数据中直接读数，这种方式不仅可以读出数据，还能实现对分析系统的各种操作；(2) 通过485数据接口以文本方式直接发送分析结果；(3) 以3路4～20 mA模拟量形式输出3个传感器的结果数据，这种方式下，可以定义20 mA电流对应各个传感器测定结果值。除了结果数据接口，仪器还提供电平控制接口和反馈输出，电平控制可以使发酵控制器通过开关信号控制取样测定，反馈输出则可以使在线分析系统用于控制发酵生化指标。反馈输出可以选用其中一个生物传感器的分析结果，设定控制目标和控制方式，根据分析结果输出反馈信号，反馈信号为周期和占空比可调节的开关信号。电平控制和反馈输出信号均通过光电隔离。

3 实验结果

3.1 10 g/L标准样品测试

用测试样机，对10 g/L葡萄糖标样进行检测实验，实验中用设定最低稀释倍数的方法强制对标样进行10倍、20倍和50倍稀释。重复10次测试结果见表4。

表4 10 g/L标准葡萄糖不同稀释实测结果比较Table 4 Practical results comparison of 10 g/L standard glucose with different dilution

由表4结果可见，当稀释50倍时，结果误差显著增大，误差增大的原因是测定浓度偏低。

3.2 模拟发酵测试

利用研制的测试样机安装葡萄糖酶电极，用1 L三角烧瓶作发酵罐模拟实验。在三角烧瓶内注入蒸馏水400 mL，NaCl 0.5 g， 200 g/L葡萄糖样品10 mL，在线分析系统设置最低稀释为不稀释，自动取样周期为10 min，取样重复次数为5次，开始自动取样测定。为保持总体积基本不变，取样测定完的样品回排到三角烧瓶内。每测定完1个样品，向瓶内补加200 g/L葡萄糖10 mL，并摇匀，20次自动取样测定结果如表5所示。

表5 不断添加葡萄糖的模拟发酵测试结果Table 5 Simulated fermentation test results of continuous addition of glucose

由表5结果可见，自动分析结果与理论计算值基本吻合，测定值误差小于5%。

3.3 工程菌发酵实测

在工程菌发酵实验中，用样机连接发酵罐，自动取样测定发酵液中葡萄糖、L-乳酸和L-谷氨酸含量，检测结果如图6所示。整个发酵过程中，谷氨酸含量一直维持在一个较低的水平，基本不变，波动应为测量误差。葡萄糖初期下降较慢，约6 h后加快，至28 h基本耗尽，而乳酸含量则不断上升，到葡萄糖耗尽后也不再变化。自动测定结果与发酵过程应有的反应吻合良好。

图6 工程菌发酵过程在线检测结果Fig. 6 Online detection results of engineering strain fermentation process

4 结语

基于生物传感器的在线分析系统检测速度快，从开始取样到得出最终结果，分析时间通常在10 min以内，包括稀释误差和分析误差，总误差小于5%，基本能够满足发酵过程自动优化控制对生化参数检测的要求。随着我国发酵工业对自动、优化控制需求的持续增长，发酵在线分析系统具有较好的应用前景。从最后工程菌发酵实际测试数据看，在线分析系统还存在偶尔测定误差偏大的情况，导致发酵曲线波动，尚需继续研究，进一步提高稀释和测定过程的稳定性，完善酶传感器性能，降低测定误差。

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Development of biosensors based online analysis system for fermentation process

ZHU Si-rong, ZHOU Wan-li, BI Chun-yuan, ZHANG Li-qun, YANG Yan,ZHANG Jin-ling, ZHAO Xiao-hua

(Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors, Institute of Biology, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014,China)

∶We developed a biosensors based online automatic sampling and analysis system in fermentation process for the requirements of automatic optimization control in fermentation process. We presented its analytical principle and structure components and detailed its automatic sampling, sample dilution and biosensor signal processing. It can automatically analyze such important biochemical parameters as glucose, lactic acid and glutamic acid, and send analytical results to fermentation controller through a 485 interface or a 4～20 mA analog interface. It can therefore provide biochemical analytical data for fermentation control. We further tested experiment prototype with glucose standard sample as fermentation broth. Results show that it has higher analytical accuracy and can satisfy the requirements of fermentation process analysis.

∶ biosensor; automatic analyzer; online analysis; glucose analysis; lactic acid analysis; automatic sampling from fermentation tank

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.015

2016-07-29

国家高技术研究发展计划(863计划)(2015AA021005)

朱思荣(1963—)男，硕士，研究员，研究方向为生物传感器研究和产品开发。Email:yanzhi@sdas.org

Q815； TP216

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