闵 红， 周志云， 杨晓莉， 李 翠

( 陕西省食品药品检验所，陕西 西安 710065)

洗发、护发化妆品微生物检查方法学研究

闵 红， 周志云， 杨晓莉， 李 翠

( 陕西省食品药品检验所，陕西 西安 710065)

为提高化妆品潜在微生物的阳性检出率，建立洗发、护发类化妆品微生物限度和控制菌检查方法。采用常规法、培养基稀释法、薄膜过滤法对4种洗发、护发类化妆品进行微生物限度与控制菌方法学研究。结果显示，飘柔长效柔顺滋养洗发露、海飞丝去屑洗发露、飘柔人参滋养润发精华素、力士密集滋养修复-发膜级精华素菌落总数检测方法分别为0.2 mL/皿法、800 mL/膜法、0.5 mL/皿法和300 mL/膜法；霉菌及酵母菌检测方法分别为300 mL/膜法、300 mL/膜法、1 mL/皿法和1 mL/皿法；除海飞丝去屑洗发露采用培养基稀释法，其他均采用常规法进行控制菌检查。建议在化妆品微生物检验前应进行微生物方法研究，从而提高化妆品“潜在”病原菌的检出率。

洗发、护发类化妆品；抑菌性；微生物方法学

洗发、护发类化妆品是现代人生活不可缺少的日用品，含有丰富的蛋白质、脂肪、无机盐和水分，有些还含有水解胶原蛋白、植物提取物、多种氨基酸等，是微生物生长良好的培养基。化妆品中常被添加防腐剂用来有效防止化妆品的二次污染，即消费者使用过程中发生的污染[1]。我国卫生部颁布的《化妆品卫生规范》中允许使用的化妆品防腐剂有56种，其中，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、凯松使用频率分别排名在前三位[2-3]。现行2007年版《化妆品卫生规范》[4]中微生物检验通过在培养基加入吐温-80或在稀释液加入卵磷脂来中和化妆品中的防腐剂等抑菌性物质。现实生活中化妆品所添加防腐剂种类繁杂，不同类化妆品防腐剂含量的差异也较大[5-7]，很难确保其能否被有效中和，从而造成化妆品中潜在致病菌的“漏检”。广州市对241份化妆品留样进行复检，发现许多合格产品在复检中超标，其中存放3年内的产品微生物复检超标率为0.82%，3年以上的为5.88%[8]。该研究同样证明了现行2007年版《化妆品卫生规范》[4]中微生物检验方法会造成化妆品中微生物的“漏检”，化妆品污染的微生物受防腐剂抑菌作用不能成长繁殖，细胞受到损伤但并未死亡，随着时间延长，防腐剂抑菌效力逐渐降低，受损微生物逐渐复苏并进行生长繁殖，从而对人类健康造成危害。因此，本研究参考USP34版中防腐体系对微生物的抑杀效果试验[9]和中国药典2010年版中微生物限度检查方法学研究[10]，选取4种常见洗发、护发类化妆品进行微生物检验方法学研究，以期通过有效减弱或消除化妆品中防腐剂等物质的抑菌作用，达到提高化妆品微生物阳性检出率的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌 大肠埃希菌(Escherichiacoli)CMCC(B) 44102、金黄色葡萄球菌(Staphylococccusaureus)CMCC(B) 26003、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)CMCC(B) 63501、白色念珠菌(Candidaalbicans) CMCC(F) 98001、黑曲霉 (Aspergillusniger) CMCC(F) 98003、铜绿假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)CMCC(B) 10104，均由中国医学细菌保藏中心提供。

1.1.2 供试品 A：飘柔长效柔顺滋养洗发露(批号：40141864F6)；B：海飞丝去屑洗发露(批号：32441864GKJ)；C：飘柔人参滋养润发精华素(批号：40350385DB)；D：力士密集滋养修复-发膜级精华素(批号：20161008BP4I)。

1.1.3 培养基 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、卵磷脂吐温80营养琼脂、孟加拉红培养基、SCDLP液体培养基、含中和剂双料胆盐乳糖、十六烷三甲基溴化铵琼脂、Baird-Parker培养基，均由北京陆桥技术有限责任公司生产。

1.1.4 仪器 HFSafe-1200LC生物安全柜(上海力申科学仪器公司)、 FC752型HTY一次性薄膜过滤器(杭州泰林生物技术设备有限公司)、LRH-250生化培养箱(上海一恒科技有限公司)、WGP-600隔水式电热恒温培养箱(重庆四达实验仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备 根据中国药典微生物限度检查法[10]进行菌液制备，采用10倍稀释法将6种试验菌稀释至50～100 cfu/mL。

1.2.2 供试液制备 根据2007年版《化妆品卫生规范》[4]进行供试品制备，首先称取样品10 g，加入90 mL灭菌生理盐水，充分振荡混匀，静置15 min，取其上清液作为1∶10的供试液。

1.2.3 微生物限度方法验证 ①常规法(1 mL/皿法)：取1 mL供试液和50～100 CFU的大肠埃希菌加入培养皿，立即倾注20 mL营养琼脂培养基，待凝固后35 ℃培养48 h，记录菌落数作为试验组；测定供试品本底菌落数，作为供试品对照组；测定相应加入的大肠埃希菌菌落数，作为菌液组。回收率(%)=((试验组菌落数-供试品对照组菌落数)/菌液组菌落数)×100%。根据公式计算供试品大肠埃希菌回收率，同法计算供试品金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率。加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌的培养皿倾注营养琼脂培养基，白色念珠菌和黑曲霉倾注玫瑰红钠琼脂培养基。供试品5种试验菌的回收率均需进行3次重复试验。若大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌3次重复试验所得回收率均高于70%，可采用常规法对供试品进行菌落总数检查；若白色念珠菌和黑曲霉的回收率均高于70%，可采用常规法对供试品进行霉菌及酵母菌数检查。若供试品任意试验菌任意一次回收率低于70%，需采用培养基稀释法继续对供试品此试验菌进行微生物方法研究。②培养基稀释法(包括0.5 mL/皿法和0.2 mL/皿法)：试验组：分别向培养皿加入供试液0.5 mL和0.2 mL，再加入各50～100 CFU试验菌，其余操作同常规法。若供试品任意试验菌任意一次回收率低于70%，需采用薄膜过滤法继续对供试品此试验菌进行微生物方法研究。③薄膜过滤法(包括300 mL/膜法与800 mL/膜法)： 试验组：将供试液以500 r/min离心3 min，取上清液10 mL加入100 mL稀释液中，再加入50～100 CFU试验菌，用1%蛋白胨缓冲液进行冲洗过滤，冲洗量分别为300 mL/膜与800 mL/膜，滤干后取出滤膜贴于培养基，测定其菌落数，作为试验组。其余操作同常规法。

1.2.4 控制菌检查方法学验证 ①常规法(大肠埃希菌：10 mL/管法，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌：90 mL/瓶法)：大肠埃希菌：取1∶10供试液10 mL，分别接入2管(10 mL/管)双倍乳糖胆盐(含中和剂)培养基，其中1管接种50～100 CFU大肠埃希菌作为试验组，另一管作为阴性对照组；金黄色葡萄球菌：取1∶10供试液10 mL，分别接入2瓶(90 mL/瓶)SCDLP液体培养基，其中1瓶接种50～100 CFU金黄色葡萄球菌作为试验组，另一管作为阴性对照组；铜绿假单胞菌：取1∶10供试液10 mL，分别接入2瓶(90 mL/瓶)SCDLP液体培养基，其中1瓶接种10～100 CFU铜绿假单胞菌作为试验组，另一管作为阴性对照组。试验组与阴性对照组均置规定温度下培养24 h后按照2007年版《化妆品卫生规范》规定[4]进行后续鉴定试验。②培养基稀释法(大肠埃希菌：10 mL/管法和50 mL/管法，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌：90 mL/瓶法和400 mL/瓶法)：大肠埃希菌：取1∶10供试液10 mL，分别接入2管(20 mL/管)和2管(50 mL/管)双倍乳糖胆盐(含中和剂)培养基；金黄色葡萄球菌：取1∶10供试液10 mL，分别接入2瓶(200 mL/瓶)和2瓶(400 mL/瓶)SCDLP液体培养基；铜绿假单胞菌：取1∶10供试液10 mL，分别接入2瓶(200 mL/瓶)和2瓶(400 mL/瓶)SCDLP液体培养基，其余操作同常规法。

2 结果与分析

2.1 微生物限度方法学

飘柔长效柔顺滋养洗发露(样品A)采用1 mL/皿法进行菌落总数方法学研究时(表1)，大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌回收率高于70%，而金黄色葡萄球菌平均回收率仅为29%，当采用0.5 mL/皿法与0.2 mL/皿法时，金黄色葡萄球菌平均回收率分别为52%和89%，应采用培养基稀释法(0.2 mL/皿法)对样品A进行菌落总数检查；飘柔长效柔顺滋养洗发露采用1、0.5和0.2 mL/皿法进行霉菌及酵母菌方法学研究时，黑曲霉回收率均为0，直到采用300 mL/膜法时，平均回收率为86%，应采用薄膜过滤法(300 mL/膜)对样品A进行霉菌及酵母菌检查。海飞丝去屑洗发露(样品B)采用1、0.5和0.2 mL/皿法进行微生物方法学研究时，5种试验菌的回收率均为0，当采用300 mL/膜法时，金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、白色念珠菌和黑曲霉回收率均高于70%，大肠埃希菌回收率为0，当采用800 mL/膜法时，回收率为96%，应采用薄膜过滤法(800 mL/膜)对样品B进行菌落总数检查，采用薄膜过滤法(300 mL/膜)进行霉菌及酵母菌检查。飘柔人参滋养润发精华素(样品C)采用1 mL/皿法进行微生物方法学研究时，除大肠埃希菌的回收率为61%，其他4种试验菌回收率均高于70%，直到采用0.5 mL/皿法时，大肠埃希菌回收率才高于70%，应采用培养基稀释法(0.5 mL/皿)对样品C进行菌落总数检查，采用常规法(1 mL/皿)进行霉菌及酵母菌检查。力士密集滋养修复-发膜级精华素(样品D)采用1 mL/皿法进行微生物方法学研究时，除金黄色葡萄球菌外，其他4种试验菌回收率均高于70%，采用0.5和0.2 mL/皿法时，金黄色葡萄球菌回收率分别为44%和61%，直到采用300 mL/膜法时，金黄色葡萄球菌回收率才高于70%，应采用薄膜过滤法(300 mL/膜)对样品D进行菌落总数检查，采用常规法(1 mL/皿)进行霉菌及酵母菌检查。

表1 微生物限度方法研究回收率Table 1 Recovery rate of microbial limit methodology

续表1

注：“/”表示由于供试品回收率已经高于70%，未进行方法学研究试验

2.2 控制菌检查方法学

飘柔长效柔顺滋养洗发露(样品A)、飘柔人参滋养润发精华素(样品C)与力士密集滋养修复-发膜级精华素(样品D)采用常规法(粪大肠菌群10 mL/管、铜绿假单胞菌90 mL/瓶、金黄色葡萄球菌90 mL/瓶)进行控制菌方法学研究时(表2～4)，试验组均检出粪大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，阴性对照无菌生长，可采用常规法对样品A、C、D进行控制菌检查。海飞丝去屑洗发露(样品B)采用10 mL/管法与20 mL/管法进行粪大肠菌群方法学研究时，试验组无菌生长，采用50 mL/管法时，试验组均检出粪大肠菌群，阴性对照无菌生长，可采用培养基稀释法(50 mL/管)对样品B进行粪大肠菌群检查；样品B采用90 mL/瓶法与200 mL/瓶法分别进行铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌方法学研究时，试验组均无菌生长，采用400 mL/瓶法时，试验组分别检出铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，阴性对照无菌生长，可采用培养基稀释法(400 mL/瓶)对样品B进行铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌检查。

表2 洗发、护发类化妆品粪大肠菌群方法学研究Table 2 Research result on methodology of fecal coliforms for shampoo and hair conditioner

注：“/”表示由于无菌落生长，未进行方法学研究试验，下表同

表3 洗发、护发类化妆品铜绿假单胞菌方法学研究结果Table 3 Research result on methodology of Pseudomonas aeruginosa for shampoo and hair conditioner

表4 洗发、护发类化妆品金黄色葡萄球菌方法学研究结果Table 4 Research result on methodology of Staphylococccus aureus for shampoo and hair conditioner

3 讨 论

在微生物限度方法学研究中，金黄色葡萄球菌代表革兰阳性菌，大肠埃希菌代表革兰阴性菌，枯草芽胞杆菌代表芽胞杆菌，白色念珠菌代表酵母菌，黑曲霉代表霉菌[11]。对抑菌物质含量低的供试品，可通过培养基稀释法减少供试品抑菌物质的浓度，从而消除其对微生物生长的影响[12]。对抑菌物质含量高的供试品，可通过薄膜过滤法将抑菌物质冲洗过滤，微生物截留在滤膜上，再将滤膜贴到适宜的培养基培养，进行微生物限度检查[13]。

试验结果表明，采用常规法对4种洗发、护发类化妆品进行微生物方法学研究时，均存在试验菌的回收率低于70%的现象，如果飘柔长效柔顺滋养洗发露金黄色葡萄球菌的平均回收率为29%，黑曲霉为0，表明其对霉菌有较强的抑菌作用，对革兰阳性菌有较弱的抑菌作用；海飞丝去屑洗发露所有试验菌的回收率均为0，表明其对所有菌群均表现较强的抑菌作用，其中对革兰阴性菌抑菌作用最强；飘柔人参滋养润发精华素大肠埃希菌的平均回收率为61%，表明其对革兰阴性菌表现较弱的抑菌作用；力士密集滋养修复-发膜级精华素金黄色葡萄球菌的平均回收率为33%，表明其对革兰阳性菌有较强的抑菌作用。

如果采用常规法(即化妆品卫生规范(2007)中微生物检验方法)进行微生物检验，势必造成“漏检”现象。因此，建议参考USP34版中防腐剂体系对微生物的抑菌效能试验[9]和中国药典2010年版中微生物限度方法学试验[10]，在化妆品微生物检验前应进行微生物方法学研究，即通过培养基稀释法、薄膜过滤法结合加中和剂等方法对化妆品检验方法进行有效性验证；以准确消除化妆品中防腐剂等抑菌物质的抑菌作用，提高化妆品潜在微生物的阳性检出率。

本研究对市场常见4种洗发、护发类化妆品进行微生物方法学研究，分析了化妆品中防腐剂等抑菌物质对特定微生物菌群的抑制作用，提出了化妆品微生物方法学验证理论。下一步将开展化妆品中防腐剂抑菌效力与微生物污染之间关系研究，希望通过对化妆品中防腐剂类型与含量的测定，得出微生物限度与控制菌的检查方法。

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Microbial Limit and Microbe-Controlling Method for Shampoos and Hair Conditioners

MIN Hong, ZHOU Zhi-yun, YANG Xiao-li, LI Cui

(ShaanxiInst.forFood&DrugControl,Xi’an710065)

In order to improve the positive detection rate of potential microbe in cosmetics, a microbial limit and microbe-controlling method for shampoos and hair conditioners was established. Routine method, medium diluting method, membrane filtration method was adopted for the study of microbial limit and microbe-controlling method. The results showed that bacterial count of Rejoice Long-lasting Soft Nourishing Shampoo, Head and Shoulders Anti-dandruff Shampoo, Rejoice Ginseng Nourishing Essence, Lux Intensive Nourishing Repairment Essence should be tested by the method of 0.2 mL/dish method (dm), 800 mL/membrane method (mm), 0.5 mL/dm and 300 mL/mm, respectively. Yeast and mold count were 300 mL/mm, 300 mL/mm, 1 mL/dm and 1 mL/dm; by routine method and routine method. Microbe-controlling except for Head and Shoulders Anti-dandruff Shampoo was tested by medium diluting method, the other were all using routine method to carry out the detection of micro-controlling. Therefore, it is suggested that before verifying microbial method, study on microbial method should be carried out, thus improving detection rates of potential microbe in cosmetics.

cosmetics of shampoos and hair conditioners; microbial inhibition; microbial methodology

陕西省食品药品检验所博士科研启动基金项目(SBSjj-201201)

闵红 女, 主管药师,博士。主要从事食品、药品与化妆品微生物检测与研究。

Tel: 029-62288452，E-mail: hong-min518@163.com

2016-01-08；

2016-02-18

Q93-332

B

1005-7021(2016)05-0103-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.018