朱海云， 马 瑜， 柯 杨， 李 勃， 孙 超

(陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043)

猕猴桃细菌性溃疡病生防菌的筛选、鉴定及其防效初探

朱海云， 马 瑜*， 柯 杨， 李 勃， 孙 超

(陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043)

从健康猕猴桃植株中筛选具有生防潜力的内生放线菌，为猕猴桃细菌性溃疡病防治提供材料。采用平板渗透法筛选对猕猴桃细菌性溃疡病具有拮抗作用的内生放线菌，通过测定不同拮抗内生放线菌发酵液对猕猴桃溃疡病病原菌(Pseudomonassyringaepv.Actinidiae,Psa)的最低抑制浓度(Minimal Inhibitory Concentrations，MIC)筛选高抗性菌株；采用喷雾法及注干法进行高抗性菌株的田间防治试验；结合形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析，明确高抗性菌株分类地位。从431株内生放线菌中筛选出7株具有明显抗性的菌株，其中菌株M109的抑菌效果最强(MIC值为0.91 mg/mL)。田间试验表明，菌株M109的喷雾法防效为72.1%，注干法防效为84.6%。分类鉴定结果显示菌株M109为肉桂地链霉菌(Streptomycescinnamonensis)。试验表明，肉桂地链霉菌S.cinnamonensisM109 对猕猴桃细菌性溃疡病防效显著，具有应用潜力。

猕猴桃细菌性溃疡病;内生放线菌;生物防治;菌种筛选;防效

猕猴桃溃疡病是一种由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)引起的细菌性病害，该病主要危害树干、枝条，严重时造成植株、枝干枯死，同时也危害叶片和花蕾[1]，不仅降低产量，而且会导致果皮变厚、果实畸形。由于该病可在短期内爆发造成大面积树体死亡，且具有适生范围广、致病性强、根除难度大等特点，已被列为我国森林植物检疫性病害[2]。自20世纪80年代初在日本首次发病以来，该病在亚、欧及新西兰等各主产区迅速蔓延[3-9]，给世界猕猴桃产业带来巨大经济损失。多年来，我国对该病的防治主要依赖于化学药剂和抗生素，但由于长期盲目过量施用农药已经造成耐药菌株的出现[10-11]，同时也导致土壤农药残留过高，土壤生态破坏等问题日益严重，因此开发新型高效、环境友好的防治药剂已成为产业界的迫切需要。放线菌是抗生素、酶和酶抑制剂等生物活性物质的主要产生菌。迄今为止，在已发现的由微生物产生的2万多种生物活性物质中，45%以上的活性物质来自于放线菌[12]。以放线菌的次级代谢产物制备的微生物农药，因具有环境友好、不易产生抗药性等特点，已成为新型农药研发和生物防治技术开发的热点。植物内生放线菌是指在生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织内部或细胞间隙而不引起植物产生明显病症的放线菌[13]。研究表明，植物内生放线菌不仅宿主分布广泛、种类丰富多样而且还能产生多种活性物质，在植物保护领域被作为生防微生物的重点开发对象[14]。自2013年以来，在对陕西关中猕猴桃主产区户县、周至县、眉县等地的猕猴桃细菌性溃疡病进行病原学研究的同时，通过从发病果园的健康植株组织中筛选能够有效抑制猕猴桃溃疡病病原菌的内生放线菌，并对其进行鉴定及防效实验，以期为开发新型猕猴桃细菌性溃疡病防治药剂提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品 分别于2013年4月及2014年4月在陕西省户县、周至县、眉县等猕猴桃主产区的果园中，自未发病的健康猕猴桃植株上采集植物根、茎、叶等组织样品共140份。

1.1.2 病原菌 丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.Actinidiae，Psa)，由陕西省微生物研究所园艺作物病害绿色防控实验室自染病植株中分离获得，现保藏于陕西省微生物菌种资源库(SMRL)。

1.1.3 培养基 高氏1号培养基：用于菌种分离及纯化；马铃薯浸汁培养基：用于形态观察；液体发酵培养基：小米 10 g，葡萄糖10 g，NaCl 2.5 g，蛋白胨 3.0 g，CaCO31.0 g，(NH4)2SO41.0 g，水1 000 mL，pH 7.4，121 ℃灭菌20 min；病原菌培养基：PSA培养基。

1.2 方法

1.2.1 内生放线菌的分离和纯化 参考陈华红、张金丽等[15-16]的方法，将所采样品以蒸馏水清洗干净后进行表面除菌，用经过灭菌处理的枝剪、解剖刀及打孔器将经过表面消毒的叶片打孔成约1 cm2的小块，根、茎切成约0.5～1.0 cm左右的小段(两端均需有切口)。组织块表面消毒采用三步法[17-18]。消毒结束后立即用无菌水将组织块漂洗3～4次，取最后一次清洗液500 μL转入无菌培养皿，倒入高氏1号培养基，于28 ℃培养3 d, 以检测消毒是否彻底。将经过表面消毒的组织块用无菌研钵研磨，以4层灭菌纱布过滤后将滤汁进行梯度稀释。选取10-2、10-3、10-4三个浓度的滤汁，加200 μL于高氏1号培养基平板上，涂布均匀后于28 ℃培养3～15 d，根据形态及颜色差异挑取不同菌落，纯化后于斜面中保存、备用。

1.2.2 拮抗菌的筛选 利用平板渗透法筛选对病原菌Psa具有显著抑制作用的内生放线菌。用直径为5 mm的打孔器在培养5 d的放线菌平板上打孔，取等量菌块接种到容量为250 mL的三角瓶中，每瓶装100 mL液体发酵培养基，28 ℃、180 r/min恒温培养7 d后将发酵液过滤除菌，滤液稀释100倍备用。将PSA培养基熔化并在水浴中冷却至50 ℃后，加入事先制备好的病原菌悬液，充分混匀，使培养基中的病原菌浓度达到1.0×106cfu/mL。取15 mL混有病原菌的培养基注入直径90 mm的平皿中并迅速摇匀，待凝固后在其上等距离放置3个牛津杯，每个牛津杯中加入100 μL稀释后的无菌发酵滤液，将培养皿平稳放入28 ℃培养箱恒温培养24 h后，依据所产生抑菌圈的大小作为筛选依据。

1.2.3 发酵液最低抑制浓度测定 参考美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)的《抗菌药物纸片法敏感性试验的实施标准》(2010)[19]，采用平板稀释法测定有抗性的内生放线菌发酵液对病原菌Psa的最低抑制浓度(MIC)。将病原菌稀释后，浓度计数至1.0×104cfu/mL。将放线菌的无菌发酵滤液按倍数稀释法加入PSA培养基，充分混匀后倒入培养皿(d=9 cm)，使PSA培养基中含有的发酵滤液的浓度分别为(20.00、16.00、12.00、8.00、4.00、2.00、0.50、0.25 mg/mL)； 以不加入发酵滤液的PSA培养基平板为对照组。分别将10 μL病原菌液加入供试组与对照组PSA平板上后均匀涂布，28 ℃培养5 d。MIC定义为99%的病原菌被完全抑制所需的最小抑制浓度。

1.2.4 菌种鉴定 ①培养特征及生理生化特性：参考《微生物分类学》[20]、《放线菌快速鉴定与系统分类》[21]及伯杰氏细菌鉴定手册(第8版)[22]中的方法进行研究。②放线菌基因组 DNA 提取与16S rDNA扩增：放线菌基因组 DNA 的提取采用Walact Bacterial Genomic DNA Purification Kit(Vicband Life Sciences company (HK) Limited)试剂盒进行，以通用引物27F/1525R为引物扩增16S rDNA。PCR反应参数：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35个循环，72 ℃延伸5 min，1%琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR产物。使用Easy Pure Quik Gel Extraction Kit(北京全式金生物技术有限公司)对目的片段进行纯化。PCR纯化产物与pMD19-T载体(大连宝生生物工程有限公司)连接，转化DH5α感受态细胞并用载体通用引物M13F/M13R筛选阳性克隆子。将筛选得到的阳性克隆送至北京六合华大基因科技有限公司进行序列测定。③分子鉴定及系统发育分析：采用NCBI的Basic BLAST对所测得的DNA序列进行同源性比对，并利用ClustalX 2.0及MEGA 5.0软件构建N-J系统发育树。

1.2.5 田间病害防治实验 于2014年2月下旬在西安市灞桥区南郑村进行，分别以全株喷雾和注干施药的方法进行防效验证，所选猕猴桃品种为徐香。①喷雾防治试验：分别用内生放线菌发酵液(含菌体)20倍液，72%农用链霉素800倍液和1.6%噻唑酮1 000倍液进行全株喷施，并设清水对照，每组处理20株，间隔7 d喷药1次，连续4次。分别于施药前和最后一次施药7 d后调查各组发病情况，并计算防效。②注干防治试验：在距离树干基部10～30 cm处向下倾斜45度钻孔到植株木质部，分别将内生放线菌发酵液(含菌体)10倍液，72%农用链霉素600倍液和1.6%噻唑酮600倍液装入输液袋(装量为500 mL)挂置在高于钻孔0.5～1.0 m处，将输液针头插入孔中进行输液。设清水对照，每组处理20株，分别于施药前和施药30 d后调查各组发病情况，并计算防效。③防效统计：参考张锋等[23]的方法，病情分级如表1所示。病情指数及防治效果计算公式如下：

防治效果(%)=

表1 猕猴桃溃疡病分级标准Table 1 Standards for grading bacterial canker of Kiwifruit in fields

1.2.6 数据处理 采用SPSS 15.0统计分析软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 内生放线菌的分离及拮抗菌筛选

研究发现，消毒后的组织块最后一次清洗液倒入高氏1号培养基，经28 ℃培养3 d后未出现菌落。说明表面消毒效果良好，排除环境及植株表面微生物污染的可能性。从获取的猕猴桃组织样品中共分离具典型放线菌特征的菌株431株，通过菌落形态、气生菌丝、基质菌丝、产色素情况及孢子形态等特征进行区分，去除重复后共得到40种不同类型的内生放线菌。采用平板渗透法对所得431株内生放线菌进行初步抗性筛选(图1)，共得到对病原菌Psa有明显抑制效果的内生放线菌7株。由表2可见，通过对其发酵滤液的MIC测定，菌株M109的抑菌效果最强，其MIC值为0.91 mg/mL。

图1 内生放线菌发酵液对病原菌Psa的抑制效果Fig.1 Inbition effects of actinomycetes fermentation broth to Psa表2 内生放线菌发酵液的最低抑制浓度Table 2 MICs of the fermentation broth of the endophytic actinomycetes

编号最低抑制浓度/(mg·mL-1)M312.74M443.16M1011.84M1090.91M1841.33M2282.48M4261.14

2.2 拮抗菌的鉴定

2.2.1 形态及生理生化特征 菌株M109初培养时菌落小(d=1.0～2.0 mm)且分散呈地衣状；最初表面光滑，后气生菌丝发育，菌落呈颗粒状。菌丝多核、纤细(d=0.5～2.0 μm)；基内菌丝多分枝，横隔稀疏，很少断裂，在马铃薯浸汁培养基上可产生紫红色色素；气生菌丝比基内菌丝稍粗，为外鞘所包，气生菌丝可部分分化成直形、柔曲、钩环状至松散或紧密螺旋形的指骨状孢子链(图2C箭头所示)，正常含50个左右的孢子，短者含5～10个孢子；孢子为节孢子，由菌丝断裂而成，孢子壁光滑。该菌株的生理生化鉴定结果如表3所示。

图2 菌株M109形态学特征Fig.2 Morphologic characteristic of strain M109A：菌落特征；B：基生菌丝；C：气生菌丝A：Colony morphology;B:Substrate hyphae;C:Aerial hyphae

2.2.2 分子生物学鉴定 菌株M109的16S rDNA PCR产物约1.5 kb，其在NCBI的注册号为KT265728。利用Basic BLAST将菌株M109的16S rDNA序列和NCBI中已登录的放线菌16S rDNA序列进行同源性比较，发现菌株M109与链霉菌属的肉桂地链霉菌(Streptomycescinnamonensis)的16S rDNA核苷酸序列同源性最为相似，利用MEGA5构建的N-J法系统发育树如图3所示。结合生理生化鉴定和同源性比对及系统发育结果，可认定菌株M109为Streptomycescinnamonensis。

注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应

图3 菌株M109的系统发育树Fig.3 The phylogenetic tree of strain M109

2.3 田间病害防治效果

由表4可见，在全株喷雾防治实验中，1.6%噻唑酮1 000倍液的效果最好，防效为76.2%；而M109发酵液20倍的效果优于72%农用链霉素1 000倍液，防效分别为72.1%和64.3%。注干法防治实验中，1.6%噻唑酮和72%农用链霉素的防治效果较差，防效分别为61.8%和54.2%；M109发酵液的效果最好，防效为84.6%。此外，经田间观察，在各实验组中，经M109发酵液注干后的猕猴桃长势明显好于其他各处理组，说明菌株M109的代谢产物中除具有抗病的活性物质外，还可能含有其他能够促进植株生长的活性物质。

表4 不同药剂及施药方法防治猕猴桃溃疡病的效果Table 4 Control efficacy of Kiwifruit bacterial canker by different agentia and methods

3 讨 论

在进行内生放线菌分离时，本研究使用了类似内生细菌分离的组织匀浆稀释涂布法，该方法可以有效减轻内生真菌(尤其是镰刀菌(Fusarium)、链格孢菌(Alternaria)等优势内生真菌种群)的干扰，通过梯度稀释在一定程度上避免优势内生细菌类群的干扰，因而获得了大量(431株)的内生放线菌。但该方法不适合分离组织内密度较低的稀有放线菌类群。利用平板渗透法对所得到的内生放线菌进行抗性筛选，获得7株具有显著抗性的菌株。但该方法仅适用于通过透明圈大小对内生菌抗性进行定性和初筛。因为受加液量的影响，发酵液在培养基中扩散后形成的透明圈半径有限，所以当有多个抗性显著的菌株存在时，其相互间的透明圈大小便难以体现各菌株间抗菌能力的真实差异。为了进一步对这些抗性菌株的抗病能力进行定量评价，本研究参考NCCLS的《抗菌药物纸片法敏感性试验的实施标准》(2010)，在相同发酵条件下，采用平板稀释法对7株抗性显著的内生放线菌发酵液进行了最小抑制浓度测定。结果显示，菌株M109的抗性最为显著，其MIC值达到了0.91 mg/mL。结合形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析，可以确认该菌株为链霉菌属的肉桂地链霉菌(Streptomycescinnamonensis)。

由于微生物产生次级代谢产物的能力一般是为了满足在特殊生长条件下的一种生理行为，有些活性代谢产物的产生可能需要特殊物质的诱导，因而体外培养的抗性筛选结果只能说明该菌株在离体条件下具有抗菌活性，无法判断其在植物组织内是否可以表现出抗性。因此，在进行田间病害防治试验时，本研究分别采用喷雾法和注干法对S.cinnamonensisM109的防效进行验证。结果表明，将S.cinnamonensisM109发酵液进行20倍稀释后进行全株喷雾，其防效可达72.1%，与现有常用化学药剂的防治效果相近。此外，通过注干法试验发现，S.cinnamonensisM109能够在猕猴桃植株体内发挥更好的抗病效果，其田间病害防效可达84.6%，显著高于对照药剂的水平。

目前，药剂防治猕猴桃细菌性溃疡病的常用方法主要包括全株喷雾处理、伤口涂抹施药、灌根给药三种方法。喷雾处理可使药液均匀分布在植株表面而形成保护层，既可预防病原菌侵染，又能起到治疗作用，但易受光照、温度、雨水等气候条件影响，防治效果不稳定。涂抹施药法是将病变部位的组织刮除后用药，药剂在短时间内直接与病原菌接触，能很快抑制病情发展，但防治时会加重果树的伤流，减弱树势，而且裸露的伤口愈合缓慢，容易导致二次感染。灌根法主要用于对根系及周边土壤中的病原进行消毒，可有效杀灭土壤中潜伏的病原菌，但用药量大、防治费用较高，而且会杀灭大量根际中的益生菌，严重破坏根际土壤的微生态环境。为了探索适用于内生拮抗菌防病的给药方法，本研究尝试将具有抗病作用的植物内生放线菌及其活性代谢产物注入猕猴桃树体内，借助伤流作用的渗透压差使其被输送至树体各部位，从而起到抑菌防病的作用。研究证明该方法是可行的，与现有的传统防治方法相比，除防效显著外，还具有用量少、操作简便、不受气候条件影响等优势。因此，作为一种新型的防治猕猴桃细菌性溃疡病的注干药剂菌株，S.cinnamonensisM109具有很好的应用开发潜力。

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Screening, Identification and Controlling Effects of Biocontrol Strain against Chinese Gooseberry or Kiwi Fruit Bacterial Canker

ZHU Hai-yun, MA Yu, KE Yang, LI Bo, SUN Chao

(ShaanxiMicrobiologyInstitute,Xi’an710043)

Endophytic actinomycetes (EA) having biocontrol potential inhibition against Chinese gooseberry (Actinidiachinensis) (CGB) or kiwi fruit bacterial canker were screened from healthy native plants of CGB to provide material to control the disease adopting plate osmotic method. Different minimal inhibitory concentration (MIC) of fermented broth of EA against CGB canker pathogenPseudomonassyringaepv.Actinidiae(Psa) was tested to screen high resisting strain (HRS), and adopt spraying method and trunk injection method to carry out field experiment for the HRS; combined with morphology, physiological and biochemical and 16S rDNA sequencing analysis to confirm the taxonomical location of the HRS. From a total of 431 EA strains were isolated from the native plants of CGB seven strains were screened that had obvious resistance against the pathogen. Among them strain M109 exhibited the strongest inhibition activities againstPsawith MIC value at 0.91 mg/mL. Field experiments showed that the controlling efficiency with spraying method was at 72% and 84.61% with trunk injection method. The strain M109 was identified asStreptomycescinnamonensis. The experiments showed thatS.cinnamonensisstrain M109 against CGB canker had a significant controlling efficiency and possessed application potential.

Chinese gooseberry (CGB) or Kiwi fruit bacterial canker; endophyticactinomycete; biocontrol; strain screen; control efficiency

陕西省农业应用技术开发项目(2014K02-10-01)；陕西省农业科技创新与攻关项目(2015NY042)；西安市农业科技

朱海云 女，助理研究员，硕士。主要从事农业微生物病害防治研究。Tel：029-85350847，E-mail：zhyhaiyun@yahoo.com

* 通讯作者。女，副研究员，博士。主要从事农业微生物应用技术研究。E-mail:wefly@ms.xab.ac.cn

2015-10-08；

2015-11-12

Q93-3

A

1005-7021(2016)05-0090-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.016

计划项目(NC1404(3))