张 艳， 王 頔， 赵运英， 蒋伶活

(江南大学生物工程学院 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122)

酿酒酵母细胞基因组中与转录因子Rim101亚细胞定位相关的磷酸酶和激酶基因的筛选

张 艳， 王 頔， 赵运英， 蒋伶活*

(江南大学生物工程学院 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122)

Rim101是一个具有锌指结构的转录因子，在调控酿酒酵母细胞耐受碱性和高盐环境、钙离子稳态、细胞分裂以及硒毒性方面起作用。前人研究结果显示，细胞周期依赖性激酶基因PHO85的缺失，导致Rim101蛋白在细胞核内积累。为了探索Rim101亚细胞定位的新调节因子，通过荧光显微镜技术对酿酒酵母细胞基因组中编码磷酸酶的73个非必需基因缺失株和编码激酶的139个非必需基因缺失株进行了筛选，发现编码磷脂酰肌醇磷酸(PtdInsP)的磷酸酶Sac1调控Rim101的亚细胞定位。

RIM101;Sac1; 磷酸酶; 激酶

酿酒酵母细胞中Rim101是一个具有锌指结构的转录因子，在应答碱性pH条件、盐耐受性、钙离子稳态、细胞分裂以及硒毒性方面起作用[1-4]。通过蛋白水解过程,Rim101被半胱氨酸蛋白酶Rim13去掉C末端大约100个氨基酸残基而被激活[5]。Rim13的水解过程需要3个不同的蛋白复合体(Endosomal Sorting Complex Required for Transport: ESCRT)ECSRT-Ⅰ、ECSRT-Ⅱ和ECSRT-Ⅲ的参与[6]。 编码ECSRT复合体组分的7个基因(SNF7、SNF8、STP22、VPS20、VPS25、VPS28 和VPS36)中的任一基因的缺失都会导致碱性条件下的生长缺陷，以及对CaCl2、LiCl和NaCl的敏感[2,7-9]。Nrg1作为钠离子泵基因ENA1的转录抑制子，而ENA1的转录又受到离子浓度、Rim101途径、钙调磷酸酶途径、Snf1 途径和Ppz1蛋白磷酸酶的调控[1,10-11]。Smp1主要在浸润性生长、产孢和促进光滑的菌落形态方面起作用[1]。Rim101的核积累可能被细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶Pho85通过磷酸化作用调控，在体外Pho85能够磷酸化 Rim101[12]。本文研究了磷酸酶和激酶对Rim101在细胞中定位的影响，证明了磷脂酰肌醇磷酸(PtdInsP)磷酸酶Sac1也调控转录因子Rim101在酵母细胞核中的积累。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 酿酒酵母菌株为野生型BY4741(MATahis3、leu2、met15、ura3),以及单倍体BY4741(MATahis3、leu2、met15、ura3)为背景的与磷酸酶相关的73个单基因缺失株(表1)，与激酶相关的139个单基因缺失株(表2)购自美国Invitrogen 公司。

表1 酿酒酵母73个编码磷酸酶的非必需基因Table 1 List of 73 nonessential yeast genes encoding phosphatases in this study

表2 酿酒酵母139个编码激酶的非必需基因Table 2 List of 139 nonessential yeast genes encoding kinases in this study

续表2

1.1.2 培养基(质量分数，%) ①LB培养基: 蛋白胨1，酵母提取物0.5，NaCl 1，pH 7.0。配置固体培养基时加入质量分数为1.5%的琼脂粉。② YPD培养基：蛋白胨2，葡萄糖2，酵母提取物1，配置固体培养基时加入质量分数为2%的琼脂粉。③SD-His培养基：酵母氮源0.67，葡萄糖2，灭菌后加入过滤灭菌过的10×必需氨基酸混合母液(不含组氨酸)，配置固体培养基时加入质量分数为2%的琼脂粉。

1.1.3 主要试剂 基因克隆相关用限制性内切酶和T4连接酶等试剂购自NEB公司；酵母转化用ssDNA、LiAc和PEG 3350等试剂购自Sigma公司；TaqDNA聚合酶和Trans1-T1大肠埃希菌感受态细胞购自北京全式金公司；Tris-Base 等其他试剂购自国药集团。

1.1.4 主要仪器 PCR反应仪(德国艾本德公司)、全温摇瓶柜(太仓强乐实验设备厂)、台式冷冻离心机(日本日立公司)、立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、凝胶成像系统(Bio-Rad)、荧光显微镜(Nikon 80i)、数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 整合用DNA片段的获得 以HIS3-ADH1-GFP-T1质粒为模板，以Rim101-N-GFP-F:gcttataaaatcatttcagacgggtgagggatgccaatctacgagacaaag-aattcgagctcgtttaaac，Rim101-N-GFP-R:ggtgcggcagt-gccattttctttattaagcagatcttccaatggcaccattttgtatagttcatcc-atgc为引物，通过PCR扩增出3.0 kb的目DNA片段。

1.2.2 酵母细胞的转化 挑取活化的酵母单菌落接种于3 mL YPD液体培养基中，30 ℃过夜培养至饱和。取500 μL过夜培养物接种到4.5 mL 2×YPD中，30 ℃培养3～4 h至对数期。12 000 r/min瞬时离心10 s收集菌体，用无菌水洗1次，再用100 μL 0.1 mol/L LiAc溶液洗2次。向细胞沉淀中依次加入240 μL 50%(质量分数) PEG，36 μL 1 mol/L LiAc，10 μL 10 mg/mL ssDNA，目的DNA 5～10 μg，1 mL吸头上下吸3～4次，涡旋充分混匀，置于30 ℃孵育30 min，42 ℃水浴热激30 min。室温3 000 r/min离心1 min收集菌体，用1 mL无菌水水洗菌体，涂布到选择性固体平板上，30 ℃培养3～4 d，获得酵母转化子。

1.2.3 酵母正确转化子的筛选 从酵母细胞转化获得的转化子中挑选出10株转化子接种到3 mL SD-HIS液体培养基中，30 ℃过夜培养。取500 μL培养物室温3 000 r/min离心1 min收集菌体，荧光显微镜观察筛选出有绿色荧光的转化子。将有绿色荧光转化子的菌液转移到1.5 mL离心管中，10 000 r/min 离心1 min收集菌体(约30～50 μL)。加入和细胞体积相当的酸性玻璃珠，将细胞重悬于200 μL STES溶液中，再加入200 μL氯仿/异戊醇(V(氯仿)∶V(异戊醇)=24∶1)。剧烈震荡10×30 s。加入200 μL TE，迅速混合，10 000 r/min离心5 min。将上清转移到新的1.5 mL离心管中，加入1/10体积3.0 mol/L NaNc，2倍体积无水乙醇，混匀，置于-80 ℃ 30 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清。加入500 μL 75%的无水乙醇，12 000 r/min 离心5 min，弃上清。室温干燥DNA 10 min，加入50 μL TE(含Rnase，终浓度为20 μg/mL)，55 ℃消化30 min。PCR扩增，电泳检测。每株基因缺失株至少获得2株正确转化子。

1.2.4 细胞预处理和荧光显微镜观察 将Rim101蛋白的N端成功整合GFP的酵母转化子的单菌落接种到含有3 mL SD-HIS液体培养基的试管中，30 ℃震荡过夜培养，取300 μL过夜培养液，加入到2.7 mL新鲜YPD液体培养基中，在30 ℃继续培养4 h至对数生长期，分别取1 mL培养液，加入到2份1.5 mL离心管中，将其中1份培养液3 000 r/min离心1 min收集菌体，然后在菌体中加入1 mL pH 8.0的YPD培养基，30 ℃培养30 min后荧光显微镜下观察GFP-Rim101融合蛋白的亚细胞定位情况。每个样品随机选取约100～200个酵母细胞进行观察，拍摄DIC和荧光照片,每个菌株随机选取2个独立的转化子做荧光定位实验。

1.2.5 pHAC111-SAC1、pHAC111-PHO85质粒的构建 用引物SAC1-F(cagtgaattcgagctcggtaccaacgatccttctttccaaacc，下划线为Kpn1位点)和SAC1-R (gaacatcgtatgggtagcatgcatctctttttaaaggatccg-

gcttgg,下划线为Sph1位点)扩增含有2.8 kb含有SAC1启动子和ORF的DNA片段。然后将这个片段克隆到pHAC111的Kpn1位点和Sph1位点。用引物PHO85-F (cgagctcggtacccggggatcccttgacatcttcttcaccgc，下划线为BanH1位点)和PHO85-R (gaacatcgtatgggtagcatgctgaagcgtggtggtagt-

ac,下划线为Sph1位点)扩增含有2.0 kb含有PHO85启动子和ORF的DNA片段。将这个片段克隆到pHAC111的BamH1位点和Sph1位点。

2 结果与分析

2.1 编码磷酸酶或激酶的基因缺失对Rim101亚细胞定位的影响

以前的研究表明敲除编码细胞周期依赖性激酶Pho85的基因，能够导致转录因子Rim101的核内积累，这个过程有可能是通过磷酸化作用实现的，因为在体外Pho85能够磷酸化 Rim101。但是，在PHO85基因的缺失细胞中Rim101的磷酸化水平和野生型相似[12]，这表明Pho85激酶可能不是使Rim101磷酸化的唯一激酶。以HIS3-ADH1-GFP-T1质粒为模板， 用引物Rim101-N-GFP-F/ Rim101-N-GFP-R通过PCR扩增出含有His3MX6-PADH1-GFP的3.0 kb左右的DNA整合片段(图1)。

为了找到Rim101亚细胞定位的新调节因子,我们把His3MX6-PADH1-GFP 片段整合到目的菌株RIM101基因的N端，这样GFP-Rim101融合蛋白的表达就在持续性(Constitutive)启动子的控制下。这些目的菌株包括野生型菌株BY4741以及表1和表2中所有基因的缺失菌株。然后在显微镜下观察GFP-Rim101融合蛋白在这些菌株对数生长期细胞中的亚细胞定位。和以前的报道一致[12]，我们发现在常用的YPD培养基中(pH 5.4)，野生型细胞中GFP-Rim101分布在细胞质内, 但是在pH 8.0的碱性YPD培养基中, 野生型细胞中GFP-Rim101积累在细胞核中。相比而言, 在pH 5.4和pH 8.0的YPD中,PHO85基因缺失株细胞中GFP-Rim101均积累在细胞核中(图2)，这说明Pho85是Rim101定位在细胞质内所必需的。通过质粒pHAC181-PHO85把PHO85基因导入到PHO85基因缺失株细胞后,GFP-Rim101在PHO85基因缺失株细胞中的亚细胞定位变得像野生型细胞中的一样(图2)。

在pH 5.4的YPD培养基中,与野生型细胞一致, 72个编码磷酸酶的非必需基因(表1)和138个编码激酶的非必需基因(表2)的缺失株细胞中, GFP-Rim101蛋白分布在细胞质中(数据未显示)。在pH 8.0的YPD培养基中，这些非必需基因缺失株细胞中的GFP-Rim10都表现出核积累，这一现象与野生型相似(数据未显示)。然而，筛选结果表明，在pH 5.4和pH 8.0的YPD培养基中，编码磷脂酰肌醇磷酸(PtdInsP)磷酸酶的SAC1基因的缺失导致GFP-Rim101在细胞核中积累(图3)。

图1 His3MX6-PADH1-GFP 整合 DNA片段的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of the DNA fragment containing the His3MX6-PADH1-GFP cassette

图2 Pho85 调控的GFP-Rim101的亚细胞定位Fig.2 Subcellular localization of GFP-Rim101 is regulated by Pho85

2.2 Sac1调控Rim101的亚细胞定位

为进一步验证上述结果，将能够表达有功能的Sac1-HA融合蛋白的pHAC111-SCA1 质粒转化到带有表达融合蛋白GFP-Rim101的SAC1基因缺失株中。结果表明，导入质粒后GFP-Rim101在细胞中的定位与野生型相似，在pH 5.4的YPD培养基中定位在细胞质中(图3)，即Sac1可以调控Rim101的亚细胞定位。

图3 Sac1调控GFP-Rim101的亚细胞定位Fig.3 Subcellular localization of GFP-Rim101 is regulated by Pho85

3 讨 论

本文研究了在pH 5.0 和 pH 8.0条件下,酿酒酵母细胞中73个磷酸酶和139个激酶基因对Rim101在细胞中的定位作用。结果表明，编码蛋白激酶Pho85的基因缺失导致GFP-Rim101在pH 5.4条件下就积累在细胞核中，这个结果与以前报道的一致[12]，同时还发现编码磷脂酰肌醇磷酸(PtdInsP)磷酸酶Sac1的基因缺失也使GFP-Rim101在pH 5.4条件下就积累在细胞核中。通过质粒把SAC1基因导入它的缺失菌株, 逆转了GFP-Rim101在pH 5.4条件下的亚细胞定位, 说明Sac1确实可以调控Rim101的亚细胞定位。Sac1在高尔基体中参与磷脂酰肌醇[4]P的水解，也定位在内质网膜上，参与蛋白质运输、加工、分泌和细胞壁维护，通过磷脂酰肌醇[4] P的水解调控鞘脂的生物合成[13-15]。

酿酒酵母细胞中SAC1基因的缺失导致Rim101在细胞核中有积累，说明Rim101在细胞核中的积累需要SAC1基因。但积累在细胞核中的Rim101是否有转录抑制活性还不能确定，因为全长形式的Rim101也能积累在细胞核并且与DNA结合，但是其转录抑制功能仍然依赖于剪切过的被激活的短的Rim101[1]。因此, Sac1调控Rim101亚细胞定位的具体机制还需进一步研究。本研究结果为Rim101途径的调控机制提供了新线索。

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Genomic Screening of Genes Encoding Phosphatases and Kinases Involved in Regulation of Nuclear Accumulation of the Transcription Factor Rim101 inSaccharomycescerevisiae

ZHANG Yan, WANG Di, ZHAO Yun-ying, JIANG Ling-huo

(Schl.ofBiotechnol. &theNat’lEngin.Lab.forCerealFerment’nTechnol.,JiangnanUni.,Wuxi214122)

Rim101 is a zinc-finger structured transcriptional factor that functions in the response ofSaccharomycescerevisiaecells to both alkaline and salt stress, calcium homeostasis, cell differentiation and selenite toxicity. Previous studies have shown that deletion of the cyclin-dependent kinase genePHO85 leads to the nuclear accumulation of Rim101. In order to identify new regulatory factors in the subcellular localization of Rim101, deletion mutants of non-essential genes encoding 73 phosphatases or 139 kinases was screened through a fluorescent microscopy approach. It was found that the encoded thosphatidylinositol phosphate (PtdInsP) phosphatase Sac1 regulates the subcellular localization of Rim101.

RIM101;Sac1; phosphatase; kinase

国家自然科学基金项目 (81371784，81571966，31301021);江南大学自主研究计划重点项目(JUSRP51313B);

张艳 女，硕士研究生。从事酵母遗传学与分子生物学研究。E-mail:1247684304@qq.com

* 通讯作者。男，博士，教授，博士生导师。从事酵母和丝状真菌遗传学与分子生物学研究。E-mail:linghuojiang@Jiangnan.edu.cn

2016-03-04；

2016-03-17

Q814

A

1005-7021(2016)05-0009-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.002

江苏市农业支撑项目(BE2014306)