徐诗文 林东强 姚善泾

(浙江大学化学工程与生物工程学院，生物质化工教育部重点实验室，杭州310027)

布洛芬与人血白蛋白位点II动态结合过程的分子模拟：一种结合途径分析

徐诗文 林东强*姚善泾

(浙江大学化学工程与生物工程学院，生物质化工教育部重点实验室，杭州310027)

人血白蛋白(HSA)主要有两个药物结合位点，位点I和位点II，许多小分子优先结合在位点II上，包括抗炎类药物布洛芬。本文采用分子模拟方法研究了布洛芬小分子与HSA位点II结合的动态过程，探讨了二者的结合机制。首先构建了50个随机分布的布洛芬与HSA复合物体系，经50 ns分子动力学模拟，其中一个布洛芬分子稳定结合于位点II。基于该分子的运动轨迹分析，发现布洛芬的结合可分为四个阶段，即远程吸引、表面结合调整、进入位点II空腔和稳定结合。比较范德华和静电相互作用能，发现初期以静电吸引为主，中期在HSA表面的两个极性区域间调整，逐步转移至位点II附近；然后在位点II入口处的极性残基和附近疏水残基的共同作用下，布洛芬进入位点II空腔；进入空腔后，静电和疏水共同作用形成稳定结合。在结合过程中，位点II附近的蛋白表面发生明显改变，体现出一定的“诱导契合”作用，同时分子模拟得到的结合模式和布洛芬-HSA结合的晶体结构类似。结果表明，分子模拟可以辅助研究小分子和蛋白结合的动态过程，从分子水平阐述相关结合机制。

人血白蛋白；位点II；布洛芬；动态结合；分子模拟

1 引言

人血白蛋白(HSA)，是人血浆中含量最丰富的一种蛋白质，占血浆总蛋白含量的60%。HSA能与许多内源性和外源性化合物结合，是一种重要的存储和转运蛋白，还具有维持血液渗透压、组成缓冲体系和为细胞提供原料等诸多生理功能。HSA由585个氨基酸残基组成，单链，呈心形，其中α螺旋约占67%，无β折叠，含有35个半胱氨酸，组成17对二硫键，结构稳定。HSA分子含有三个结构类似的α螺旋区域，分别称为域I、域II和域III，每个结构域又可分为两个亚域，见图1。Sudlow等1指出HSA分子主要有两个疏水性药物结合位点，分别为位于域IIA的位点I(华法令结合位点)和位于域IIIA的位点II(吲哚结合位点)。其中位点II更接近分子表面，且活性较高，易于与小分子结合，许多药物如布洛芬、洋地黄毒苷等优先结合在位点II上2。位点II由六个α螺旋构成一个独特的空腔结构，入口处由极性残基组成，可提供静电相互作用和氢键；空腔中部为疏水性残基，可提供疏水作用；空腔底部可针对不同分子提供疏水、氢键和静电等杂合作用。对于较大分子量的药物，如地西泮，位II还存在一个由LEU387等侧链偏转形成的亚腔3。

布洛芬，化学名为α-甲基-4-(2-甲基丙基)苯乙酸，分子结构式见图1，是世界卫生组织、美国FDA唯一共同推荐的儿童退烧药，也是儿童首选抗炎药，还适用于骨关节炎、类风湿性关节炎和神经炎等治疗4。布洛芬的羧基在pH中性条件下解离，带一个单位负电荷。布洛芬与HSA结合的晶体结构已经解析，蛋白质数据库编号(PDB ID)为2BXG，存在两个结合位点，其中位点II最为常见，结合模式见图1，由位点II入口到空腔内部形成静电、疏水和杂合的典型三层相互作用分布5。带负电荷的羧基可与位点II空腔入口处三个带正电荷的残基发生静电相互作用；布洛芬的苯环与空腔中部环状分布的4个亮氨酸形成强疏水相互作用；布洛芬分子尾部的异丁基链可与空腔底部的疏水残基发生作用。布洛芬与HSA位点II的稳定结合，取决于布洛芬分子和位点II空腔的独特结构6－8，虽然最终结合方式目前已经了解，但结合的动态过程仍旧未知，HSA是如何吸引布洛芬分子，布洛芬分子又是如何进入位点II的空腔口袋，这些信息的获得将提高人们对HSA-小分子结合过程的机制认识，有助于结合配基的优化设计。

图1 HSA(a),布洛芬(b)以及二者结合(c)示意图Fig.1 HSA(a),ibuprofen(b),and the ibuprofen-HSA binding(c)

近些年来，随着分子模拟技术的不断发展，越来越多的蛋白与小分子的结合模式和机理可以在分子水平上得到阐述，同时分子模拟的结果也为配基设计提供了理论依据，遗憾的是蛋白-小分子结合的动态过程研究很少9－12。本文采用分子动力学模拟的方法，以布洛芬与HSA位点II的动态结合过程为研究对象，分析结合途径，考察结合过程的分子识别、分子相互作用、结合能量和蛋白构象变化，探讨主要作用力、关键残基和结合机制，并与结合的晶体结构进行比较，获得规律性认识，为基于HSA位点II的配基设计和HSA分子改造提供指导。

2 分子模拟方法

HSA的晶体结构从蛋白数据库(Protein Data Bank，http://www.rcsb.org/pdb/)下载，包括未结合小分子的HSA晶体结构(PDB ID：1AO6)和HSA-布洛芬复合物的晶体结构(PDB ID：2BXG)。采用H++在线平台13(http://biophysics.cs.vt.edu/)计算HSA氨基酸残基在pH 7.4生理条件下的质子化状态，盐浓度设为0.15 mol·L－1，蛋白质内部介电常数为10，外部介电常数为80，其它参数为默认。布洛芬分子由Discovery Studio 3.0(DS 3.0)14构建，采用Dreiding力场优化15，各原子的质子化状态依据Marvinsketch计算的pKa值确定16。

为了让本文分子模拟工作更具有意义和挑战，采用1AO6作为HSA的起始构象，探讨其与随机分布的布洛芬分子的自由结合过程。布洛芬分子的随机分布由packmol软件17实现，以HSA为中心，在边长12 nm的立方体中随机分布50个布洛芬分子构建复合物体系，见Supporting Information中图S1所示。

分子动力学模拟采用Gromacs 4.5.4软件18，温度设为300 K，采用周期性边界。具体模拟过程如下：首先添加GROMOS96的43a1力场，采用spc水模型进行溶剂化19，最小边界厚度为1 nm，添加Na+以中和系统中的负电荷；其次，采用最陡下降法(steepest descent)进行5×104步能量最小化，再分别进行100 ps的等温等容平衡(NVT)和等温等压平衡(NPT)；最后，在常温常压下进行50 ns的分子动力学模拟，前15 ns为50个布洛芬分子和HSA的完整体系模拟，后35 ns集中于位点II结合的布洛芬分子模拟。

分子模拟的参数设置如下：体系温度采用V-rescale算法20，压力采用Parrinello-Rahman算法21。远程范德华力(VDW)的阀值为1.4 nm，静电相互作用采用Partical Mesh Ewald(PME)算法22，截断半径值为1.4 nm。采用LINCS算法23固定共价键，相对偏差为10－4。体系时间步长为0.002 ps，每隔10 ps取一次坐标和能量值。非键能量用g_energy模块计算，其中LJ-(SR)和Coulomb-(SR)分别代表范德华能(ELJ)和静电作用能(ECoul)，非键总能量(Etotal)为二者之和。

布洛芬与HSA晶体结构(PDB ID：2BXG)的分子动力学模拟步骤和参数同上，模拟时长为5 ns，计算二者的ELJ、ECoul和Etotal，并与随机分布的HSA-布洛芬模拟结果进行比较。

所有分子模拟均在曙光工作站A620r-G上进行。前15 ns，由于50个随机分布的布洛芬-HSA模拟体系较大，共有近70万个分子，分子动力学模拟运行的速度约为0.2 ns/天；后期35 ns，单一布洛芬分子结合的模拟体系约有10万个分子，运算速度约1 ns/天。一个批次50 ns分子模拟总耗时约110天。

3 结果和讨论

3.1HSA分子的结构分析

首先将未结合小分子的1AO6与结合有布洛芬的2BXG两个HSA域IIIA结构进行比较，结果发现位于位点II空腔入口处的残基差异较大，如Supporting Information中图S2所示。对于1AO6，组成空腔入口处的残基为ARG410、LEU387、SER489和LYS414等四个残基，由于受ARG410残基阻挡，空腔入口较小；而对于2BXG，ARG410残基发生位移，增加两个残基ASN391和GLN390共同形成空腔入口，因此入口显著增大，有利于小分子的结合。

为了让本文布洛芬-HSA结合的分子模拟更加具有普遍性，以1AO6作为HSA的起始构象，探讨随机分布的布洛芬分子的自由结合过程。

3.2布洛芬与HSA结合的动态过程解析

分析50个随机分布于HSA周围的布洛芬分子在前15 ns分子模拟过程的运动轨迹，可以发现有6个分子结合到HSA表面，分别位于域IA(2个)，域IIIA(2个)和域IIIB(2个)，其中一个布洛芬分子从HSA位点II距离3 nm外开始接近并最终结合于位点II。比较上述6个布洛芬分子在14－15 ns之间的平均结合能，发现结合于域IA的一个分子和位点II附近布洛芬的结合能较大，绝对值大于200 kJ·mol－1，但前者波动较大，后者结合较为稳定。因此，后续以该布洛芬分子运动轨迹作为一种可能的位点II结合途径，进行系统分析。

对于结合于位点II的布洛芬分子，其与位点II中心的距离、结合过程的静电作用能、范德华能和总能量变化见图2。仔细分析该布洛芬分子进入位点II的运动轨迹和能量变化，可以发现布洛芬与HSA的结合过程可分为四个阶段：远程吸引、表面结合调整、进入位点II空腔和位点II稳定结合。在前5.5 ns内，二者间的距离波动较剧烈，结合能较小，约4.8 ns时静电作用能开始出现并持续增大，表明布洛芬分子受静电吸引而接近HSA表面，即第一阶段的远程吸引；5.5－16 ns之间，距离略有波动然后稳定，相互作用能也相应持续负值增大后稳定在－200 kJ·mol－1左右，形成第一个能量稳定平台，即第二阶段的表面结合调整；16－18 ns之间，二者间的距离小幅持续增大，静电作用能发生突变，由－200 kJ·mol－1变化到－400 kJ· mol－1后回落至－250 kJ·mol－1左右，分析轨迹发现此阶段布洛芬分子进入HSA位点II的空腔；18 ns后，二者间的距离基本稳定，能量波动较小，最后平稳在更低的能量平台上，约－280 kJ·mol－1。以下具体分析四个阶段的动态结合过程。

3.3阶段I：远程吸引

图2 布洛芬分子与位点II中心的距离及其与HSA结合的能量变化Fig.2 Distance between ibuprofen and the center of Site II and the interaction energies of ibuprofen on to Site II of HSA

分子模拟的初始阶段(0－5.5 ns)，开始时HSA和布洛芬分子没有明显接触，无明显的非键相互作用，静电作用能和范德华能基本为0。5.0 ns左右，布洛芬分子已经接近HSA表面。从图3中可以发现，pH 7.4时，虽然HSA整个分子带有6个净负电荷，但是表面电荷分布不均匀，位点II附近存在明显的正电区域。分析表明，布洛芬分子带有负电荷，带正电的LYS545可通过与布洛芬分子羧基的静电吸引作用，将其“吸引”至HSA蛋白表面，因此静电作用能急剧增大。当布洛芬分子到达HSA表面后，位点II附近带正电的LYS541同时发挥作用，静电作用能持续增大，范德华能也逐步增大，促进布洛芬分子稳定结合于HSA表面。分析能量贡献，可以发现该阶段主要以长程的静电吸引力为主。

图3 HSA表面电势分布(pH 7.4)以及不同分子模拟时刻布洛芬的相对位置Fig.3 Isopotential surface of HSAat pH 7.4 and the position of ibuprofen molecule at different simulation time

3.4阶段II：表面结合调整

该阶段(5.5－16 ns)布洛芬分子已经结合到HSA域III的表面，不过在两个极性区域(域IIIB的LYS541/LYS545和域IIIA的ARG410/LYS414)之间波动，范德华能和静电能总体呈现逐步增大后趋于平稳。

分析该阶段不同氨基酸残基和布洛芬分子的静电相互作用能，发现4个残基最为重要，分别为ARG410、LYS414、LYS541和LYS545，均带正电荷，其中LYS541和LYS545位于域IIIB，ARG410和LYS414位于域IIIA，形成两个极性正电区域。分别计算两个极性区域的静电作用能，结果见图4。可以发现，初期(5.5－8 ns)主要由域IIIB的LYS541和LYS545控制，其中LYS545还可与布洛芬分子形成氢键(见图5(a))；后期(8－16 ns)由域IIIA的ARG410和LYS414主导，ARG410也与布洛芬分子形成氢键(见图5(b))。也就是说，布洛芬分子由域IIIB迁移到了域IIIA，接近位点II的空腔入口。该阶段范德华能贡献较大的残基为ARG410、 LEU407、 LEU394、 GLN390 和ALA406，其中疏水残基ALA406、LEU407和LEU394可与布洛芬的苯环发生疏水性作用；12 ns后，范德华能起主导作用为疏水残基LEU407和LEU394。从图2可以发现，6 ns时总结合能为－100 kJ·mol－1左右，6－16 ns期间持续负值增大，16 ns时达到－200 kJ·mol－1，说明经过局部调整达到了更有利于布洛芬结合的状态。此外，静电作用能和范德华能同步负值增大，表面静电和疏水相互作用共同促进了布洛芬分子的表面结合调整。

3.5阶段III：进入位点II空腔

图4 两个极性区域的静电相互作用能比较Fig.4 Comparition on the electrostatic interaction energies of two polar regions

图5 6 ns(a)和16 ns(b)时布洛芬分子与HSA表面的结合示意图Fig.5 Binding modes of ibuprofen on the surface of HSAat 6 ns(a)and 16 ns(b)

该阶段主要集中于16－18 ns，布洛芬分子进一步从ⅢA极性区域进入到HSA位点II的空腔。从图2可以看出，结合能量进一步增大，其中静电作用能变化剧烈，说明布洛芬分子的结合再次调整，而范德华能持续增大，从而形成更稳定的结合。

分析该阶段不同氨基酸残基的静电作用贡献，发现位于前三位的是ARG410、LYS414和 TYR411，均位于位点II空腔的入口处。不过，三个残基的静电作用能变化体现出不同的规律，具体见图6。ARG410带有正电荷，与布洛芬分子的静电作用能相对稳定，平均约－73.2 kJ·mol－1，不过波动较大，在－167.6到－10.4 kJ·mol－1范围内变动，ARG410还可与布洛芬分子形成较稳定的氢键；LYS414也带有正电荷，静电作用能变化剧烈，16.7 ns之前约为0 kJ·mol－1，16.7 ns时突然变化到－200 kJ·mol－1，18 ns左右又趋于－50 kJ·mol－1左右；而TYR411仅在17.8 ns左右开始发挥作用，由0突然变到－80 kJ·mol－1左右。仔细分析这些残基的空间分布，可以详细了解布洛芬分子如何从HSA表面进入到位点II的空腔中。该阶段3个关键时间点(16.5、17.3和18 ns)的典型结合见图7，可以发现ARG410、LYS414和TYR411的空间位置依次深入空腔内部。前期为最外侧的ARG410主导，布洛芬开始接近空腔；中期以LYS414主导，布洛芬逐步进入空腔；后期TYR411贡献的能量开始增大，同时布洛芬与ARG410的氢键断裂并开始与TYR411形成氢键，促使布洛芬进入了空腔的深处。

此外，范德华能贡献较大残基有LEU387、LEU394、LEU407和LEU430等4个亮氨酸和PHE488，其中LEU387和PHE488的范德华能逐渐增大并起主导作用。比较该阶段的静电作用能和范德华能数值，可以发现二者波动较大，且绝对值均较第二阶段变大，静电作用变化更明显，说明静电作用和疏水作用共同促使小分子从位点II入口处进入空腔。总能量也达到了更低的平台，结合更加稳定。

3.6阶段IV：位点II稳定结合

图6 阶段III中三个关键残基的静电作用能变化Fig.6 Electrostatic interaction energies of three key residues at the binding phase III

图7 阶段III中三个关键时间点(16.5 ns(a)、17.3 ns(b)和18 ns(c))布洛芬与位点II入口残基的结合示意图Fig.7 Binding modes of ibuprofen on the entrance of site II atthebindingphaseIII(16.5ns(a),17.3ns(b),and18ns(c))

18 ns后，布洛芬分子进入位点II的空腔，经细微调整，形成了稳定的结合。分析该阶段布洛芬分子运动轨迹，发现波动很小，说明了结合较为稳定；静电作用能和范德华能变化不大，基本保持在－150和－130 kJ·mol－1。

分析不同氨基酸残基贡献，发现静电作用的主要残基有ARG410、TYR411、ARG485和SER489，布洛芬分子的羧基与上述除ARG485外的三个残基均形成了氢键，使结合更为稳定。从范德华能贡献上看，主要疏水残基有LEU387、LEU407、VAL426、LEU430、LEU453、PHE488等6个。具体分析这些关键残基的空间分布，可以发现静电相互作用集中于位点II空腔的入口，而疏水作用分布于空腔的中部和深处，具体见图8(a)。 ARG410、TYR411、ARG485和SER489等位于空腔入口处的极性残基与布洛芬的羧基发生静电相互作用；空腔中部的LEU387、LEU407和LEU430等疏水残基主要与苯环发生疏水作用；而深处的VAL426、LEU453和PHE488等疏水残基可与布洛芬的异丁基发生疏水作用。

对HSA-布洛芬结合的晶体结构(PDB ID：2BXG)也进行5 ns的分子动力学模拟，并与前文布洛芬分子自由结合的分子模拟结果进行比较，结果如图8(b)。发现晶体结构中HSA-布洛芬结合能为－392.8 kJ·mol－1，其中静电作用能－291.3 kJ· mol－1，范德华能－101.5 kJ·mol－1，总能量值绝对值比前文的模拟结果大，其中静电作用能偏大，但范德华能稍小。不过，总相互作用能量排名前10位的残基中有8个与前文分子模拟体系相同，其中提供静电作用有4个相同(分别为ARG410、TYR411、ARG485和SER489)，主要与布洛芬的羧基发生静电作用；范德华能中4个相同，分别为LEU387、LEU407、LEU430和LEU453，围绕在布洛芬的苯环周围，主要贡献了疏水作用。

图8 布洛芬-HSA位点II结合比较Fig.8 Comparison on the binding modes of ibuprofen on site II of HSA

比较稳定结合布洛芬后1AO6模拟体系和2BXG的HSA-布洛芬晶体结构，发现二者位点II的均方根偏差在0.2 nm之内，仔细比对空腔内的残基分布，发现基本一致。进一步比较布洛芬分子发现，布洛芬头部羧基均位于位点II空腔入口处的极性区域，但苯环及尾部侧链的位置不同。晶体结构中布洛芬分子的苯环进入由4个LEU组成的环内，而模拟体系的布洛芬分子则“停靠”在外侧，4个LEU并没有形成可以容纳布洛芬苯环的环状分布，而是处于4个LEU和VAL426、PHE488等疏水残基组成的另一个疏水腔中，该疏水腔的疏水性略大于晶体结构中四个LEU围城的环状疏水区域，因此也是一个潜在的结合状态。

3.7结合过程中HSA分子的“诱导契合”效应

在模拟体系的四个阶段中，HSA域III多个残基通过改变空间位置以适应布洛芬分子的结合，Rehman等24也报道了HSA在结合小分子时结合部位残基发生一定程度的结构变化。第一阶段，位于域IIIB极性区域的LYS541和LYS545带正电的侧链波动较大，与布洛芬的羧基形成了静电吸引作用，通过动态调整而牵引布洛芬分子至蛋白表面，并与LYS545形成氢键；第二阶段，域IIIA极性区域的带正电残基(ARG410和LYS414)开始与域IIIB极性区域竞争布洛芬分子，此时ARG410、LYS414、LYS541和LYS545四个带正电的残基共同竞争与布洛芬羧基的结合机会，通过侧链的摆动使布洛芬在域IIIB(LYS541和LYS545)和域IIIA (ARG410和LYS414)间不断调整，最后IIIA极性区域起主导作用，布洛芬分子靠近位点II；第三阶段，位点II空腔入口的3个带正电残基ARG410、LYS414和TYR411依次起到静电吸引作用，三个残基通过自身空间位置的变化以适应布洛芬的结合，引导布洛芬分子逐步进入空腔口袋，此时空腔深处的PHE488等疏水性残基通过侧链调整使空腔容积变大，促使布洛芬更容易进入空腔；第四阶段，结合能量趋于稳定，位点II周围的残基运动幅度减小，布洛芬和位点II形成稳定结合，布洛芬分子头部的羧基与ARG410、TYR411、ARG485和SER489发生静电作用，苯环与LEU387、LEU407、VAL426、LEU430、LEU453和PHE488等疏水残基发生疏水作用。结合过程的热点残基与Dantas等25通过密度泛函理论计算出的布洛芬与位点II结合可能的关键残基类似。布洛芬分子和HSA结合四个阶段的动态过程见视频文件(Supporting Information)。整体而言，在布洛芬的动态结合过程中，HSA位点II附近的氨基酸残基通过不断的动态调整，适应布洛芬分子的结合、迁移和进入位点II空腔，体现一定的“诱导契合”作用。

4 结论

经随机分布的布洛芬分子动力学模拟，发现一个布洛芬分子与HSA位点II结合的可能途径，通过分析运动轨迹，比较了范德华和静电相互作用能，了解二者结合的动态过程。发现布洛芬-HSA位点II结合可分为四个阶段：远程吸引、表面结合调整、进入位点II空腔和位点II稳定结合，初期以长程静电吸引为主，中期在HSA域Ⅲ的两个极性区域间波动，逐步转移至位点II附近；然后在位点II入口处的极性残基和附近疏水残基的共同作用下，布洛芬进入位点II空腔；进入空腔后，静电和疏水共同作用形成稳定结合。在结合过程中，位点II附近的关键氨基酸残基波动较大，蛋白表面发生明显改变，通过“诱导契合”作用促使布洛芬分子进入位点II空腔。比较发现，分子模拟得到的结合模式和布洛芬-HSA结合的晶体结构类似。结果表明，分子模拟可以用于探究小分子和蛋白结合的动态过程，深入了解结合过程的微观变化，从分子水平阐述结合机制，同时也可为特定位点的药物和分离配基设计提供指导。

Supporting Information:50 ibuprofen molecules around HSA at the initial state of molecular simulation,the comparison on the surface of Site II of HSA(1AO6 and 2BXG)and a video of ibuprofen binding on Site II of HSA in 30 ns have been included.This information is available free of charge via the internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.

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Molecular Simulations on Dynamic Binding of Ibuprofen onto Site II of Human Serum Albumin:One Potential Way Analysis

XU Shi-Wen LIN Dong-Qiang*YAO Shan-Jing
(Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education,College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University,Hangzhou 310027,P.R.China)

Human serum albumin(HSA)has two main drug binding sites termed SiteIand SiteII.Most small molecules like ibuprofen(a well-known anti-inflammatory drug)bind to SiteIIpreferentially.In this study, molecular simulation methods were used to investigate the dynamic binding process of ibuprofen to SiteII.A system of 50 ibuprofen molecules distributed randomly around HSAwas constructed.After a 50-ns molecular dynamics simulation,one ibuprofen molecule bound stably to SiteII.Based on trajectory analysis of this ibuprofen molecule,the binding process of ibuprofen onto SiteIIcan be divided into four phases:(i)long-range attraction;(ii)adjustment on the surface;(iii)entering to SiteIIpocket;and(iv)stable binding at SiteII.After evaluating van der Waals′and electrostatic interaction energies during the binding process,it was found that the initial major driving force involves electrostatic attractions.Subsequently,ibuprofen locks between two polar regions on the surface near SiteIIand then moves to SiteII.Ibuprofen then enters the pocket of SiteIIby combinatorial effects of polar and hydrophobic residues nearby the entrance of SiteII.Electrostatic and hydrophobic interactions form the stable binding of ibuprofen in SiteII.The molecular surface near SiteIIwas observed to change significantly during binding,which indicates an induced fit mechanism.The binding mode obtained with molecular simulations is consistent with the crystal structure of the ibuprofen-HSAcomplex.Theresults show that molecular simulations would help to evaluate the dynamic binding processes of small molecules to proteins and improve our understanding of the binding mechanisms at the molecular level.

Human serum albumin;SiteII;Ibuprofen;Dynamic binding;Molecular simulation

O641

10.3866/PKU.WHXB201609131

Received:May 25,2016;Revised:September 13,2016;Published online:September 13,2016.

*Corresponding author.Email:lindq@zju.edu.cn;Tel:+86-571-87951982.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21476198,21276228,21576233).

国家自然科学基金(21476198,21276228,21576233)资助项目