廉玉利++李依娜++王炜琪++孟德勇

【摘 要】本文阐述了生长素的种类和生物合成过程，色氨酸单加氧酶是细菌中生长素生物合成过程中的重要限速酶，其编码基因iaaM已被克隆并在植物基因工程得到广泛应用。本文重点综述了转化iaaM基因可增加植物内源生长素的含量，在改善植物的生长发育状况，提高作物产量，改良作物品质，诱导单性结实，参与抗逆反应等方面起到了显著作用，并分析了iaa M基因在植物基因工程中应用研究方向。

【关键词】生长素 色氨酸单加氧酶 植物基因工程

【Abstract】In this paper， the species and biosynthetic process of auxin are elaborated. In bacterium， tryptophan monooxygenase catalyze the rate-limiting step of auxin biosynthesis， and its coding genes have been cloned and used widely in plant genetic engineering .The overview of the iaaM gene transformation can be increased endogenous auxin content which has significant effect in improving growth and development， increasing crop yield and altering crop quality， serving？as？selectionmarker？gene， inducing parthenocarpy， participating in the stress resistance and other aspects.At the last， the paper analyzed the application and research direction of the iaaM gene in plant gene engineering.

【Keywords】auxin； tryptophan monooxygenase gene （iaaM）； plant genetic engineering

生长素是调控植物生长发育最重要的植物激素之一。生长素在调节植物细胞分裂与伸长、向性运动、顶端优势、细胞衰老、花器官的形成、逆境应答等生长发育都具有十分重要的作用，它对植物的早期发育和形态建成均具有重要意义。色氨酸单加氧酶（IAAM）是细菌中吲哚乙酰胺途径催化生长素生物合成的关键酶，也是最重要的限速酶。本文就生长素的合成、色氨酸单加氧酶基因（简称iaaM基因）以及其在植物基因工程上应用进行了综述，旨在为探索生长素合成机理和生理作用机理及色氨酸单加氧酶基因在植物基因工程上应用奠定理论基础，同时也为通过基因工程手段调整植物激素水平进行作物遗传育种展示了广阔的应用前景。

1 生长素素的生物合成与iaaM基因

研究生长素合成的分子基础、生化机制以及合成限速酶，对界定生长素在植物发育中的功能、利用基因工程技术调整生长素在植物中的含量以及调节植物生长发育都具有重要作用。

1.1 生长素的生物合成

生长素主要包括3-吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、4-氯吲哚乙酸（4-Cl-IAA）和苯乙酸（PAA）四种类型。IAA是天然植物生长素的主要活性成分，是最早发现的促进植物生长的激素，依据IAA合成过程的中的主要中间产物，把依赖色氨酸的生物合成过程划分为4个途径（图1）：吲哚乙腈途径、吲哚乙酰胺途径、吲哚丙酮酸途径和色胺途径。其中吲哚乙腈途径是植物生长素合成过程的次要途径，在植物的特殊发育阶段或特殊环境下启动，主要存在于十字花科、禾本科、芭蕉科等的一些植物中，最近在葫芦科、茄科、豆科和蔷薇科也发现腈水解酶活性，但在水稻、玉米、烟草中尚未发现该途径；吲哚乙酰胺途径仅存在于铜绿色假单胞菌、植物伴生菌和农杆菌等细菌中，能使寄生植物形态发生改变，本途径在植物中尚未发现。吲哚丙酮酸途径是高等植物合成IAA的主要途径，在巴西固氮螺和阴沟肠杆菌等根际固氮菌中也存在该途径；色胺途径常与吲哚丙酮酸途径同时进行，是大麦、 燕麦、烟草、豌豆、拟南芥等植物IAA合成重要途径[1]。如图1所示。

1.2 iaaM基因

目前在生化和遗传上都研究比较透彻的IAA合成途径是吲哚乙酰胺途径，该途径最早发现于假单胞菌，后来在植物伴生菌中得到鉴定。在根癌农杆菌中（图1），iaaM基因编码色氨酸单加氧酶，它催化色氨酸转变为IAM，iaaH基因编码吲哚乙酰胺水解酶，催化IAM生成IAA的反应，吲哚乙酰胺水解酶是生长素在细菌中生物合成重要限速酶[2]。在拟南芥和烟草中发现的吲哚乙酰胺水解酶与细菌的IAAH催化区域序列同源，都能催化吲哚乙酰胺（IAM）合成IAA，然而，植物尚未发现 iaaM基因和色氨酸单加氧酶，因此植物中存在的该途径与细菌生物合成IAA过程相似但不相同[1]。

研究微生物中IAA合成途径的对开展植物体内IAA合成的研究具有重要启示作用。利用基因工程手段把iaaM基因克隆并转化到植物中，观察转基因植物从分子水平到表型的变化，从而能为研究和调控植物中IAA的表达水平提供强有力的证据支持。

2 iaaM基因的应用

已有研究表明通过转化iaaM基因可增加植物内源的生长素的含量，具有改善植物的生长发育状况，提高作物产量，改良作物品质，诱导单性结实，参与抗逆反应等作用。

2.1 对生长发育的影响

生长素对植物形态发育与建成起着重要作用，利用农杆菌来源的iaaM基因的遗传转化，有助于研究转基因植物中生长素水平变化对植物营养器官形态发育的影响。李朝霞[3]研究表明随着转iaaM基因植株的IAA水平升高，保卫细胞的长度增加、栅栏组织细胞增大和叶片厚度增加、而气孔密度减小，叶片长度减少50%，单位面积叶片的细胞数减少，而体积增大，可能是由于过量生长素水平可能减少叶原基分生细胞的分裂次数，但能促进叶细胞生长和分化。荆风雪[4]将来源于棉花纤维细胞高效表达的E6基因启动子与iaaM构建重组基因转化黄花蒿，结果表明转基因植株的腺毛密度与对照组相比提高了约21%，腺毛细胞大小约增加1.16倍。彭彦等[5]将拟南芥韧皮部特异启动子ASUS1基因启动子和iaaM融合基因转入烟草，发现大多转基因烟草都出现生长异常的生长素过度表型且生长迟缓、叶片卷曲，较野生型烟草植株相比茎的横切面韧皮部细胞数量显著增加，排列更加紧密整齐，木质部分化较早，其根部则在韧皮部薄壁细胞处诱生大量根原基，茎段有大量不定根分化，在不定根上有大量侧根和根毛的分化。TV Bavrina[6]和VV Alekseeva[7]研究也发现而转iaaM基因植物中的IAA水平若过量增加，将会引起植株形态不正常，不定根增多，种子不萌发。

2.2 提高作物产量，改良作物品质

生长素具有诱导光合产物向其含量高的部位运输的能力，是提高灌浆效率的重要调控因子，说明局部生长素合成对作物籽粒灌浆具有重要的生物学功能。在生产实践中，提高内源或外源生长素水平可有效增加结实率和座果率，增大果实和提高籽粒的重量以提高作物的产量和品质。

Zhang等[8]利用矮牵牛种子表皮特异启动子FBP7驱动iaaM基因的表达既特异提高了棉花胚珠表皮生长素的含量，且对棉花生长发育和其他农艺性状也产生影响。实验结果表明转FBP7：iaaM基因棉花的种子表皮纤维数量增加且衣分可以达到48%以上，提高了近15%，纤维细度也有明显改善，实现产品和品质性状同步提高。Mezzetti B等[9]等将驱动胚珠及子房基因的特异表达的启动子DefH9与iaaM融合基因导入蔷薇科的草莓和覆盆子，研究结果表明转基因植株花序的数量和每个花序的座果数量均增加，单个果实的重量和尺寸也增加，最终使转基因草莓和覆盆子的产量分别增加180%和100%，同时能使去雄的转基因草莓和覆盆子单性结实。文秀红[10]将种子特异启动子SSP与iaaM融合基因转入油菜，转基因植株在形态上未表现出生长素含量过高的表现，植株的种子增大增多，增产达15.2%。研究者们利用IAA可使植物的茎伸长、木质化加剧的特点，发现转iaaM基因的杨树或其他木材植物，节间伸长，叶面积增大，有强的顶端优势，高度和茎的直径均增加，增加了其作为木材的优良品质[11，12]。对转基因番茄、葡萄、草莓等果蔬的成分分析表明，果实颜色、可溶性固体、干物质总量、有机酸、总多酚等果实质量相关重要参数无明显差异。

2.3 作为选择标记基因

iaaM基因作为一个选择标记基因，其表达有利于促进不定芽的分化并导致转基因植株表型发生反常变化。因此，iaaM基因可作为简单的表型标记筛选转化子，直观的指示转化是否成功。刘春明等将iaaM和iaaH基因导入烟草细胞后，可以在没有2， 4-D的情况下诱导体细胞胚的形成[13]。Zheng X[14]等将p35S（CaMV35S启动子）-pAGL5（胚珠特异启动子）-iaaM、p35S-iaaM、pAGL5-iaaM、pNOS（农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子）-pAGL5-iaaM 4个表达载体转化烟草，结合植株的表型变化和RT-PCR检测iaaM基因在根、茎、叶、花、果实中的表达水平，证明了CaMV35S启动子具有将毗邻的组织或器官特异启动子覆盖的能力。Alida Ballester[15]利用ipt（异戊烯基转移酶基因）联合iaaM/H作为选择标记基因遗传转化柑橘和甜橙时，转化率分别达7.2%和6.7%。

2.4 诱导单性结实

单性结实是人们获得无籽果实的有效途径之一，iaaM基因的胚珠特异性表达提高果实中生长素浓度，刺激子房发育成果实，可创造遗传稳定的单性结实品种，为植物单性结实育种提供了新的基因和思路。Rotino等把DefH9与iaaM融合基因导入茄子，提高IAA在胚珠、子房等组织的合成水平，获得100%的单性结实座果率，产品质量也得到了提高。Pandolfini等将改良融合基因DefH9-RI-iaaM导入番茄，所结单性番茄果实无畸形果且品质较高。目前，iaaM基因已被应用用于烟草、覆盆子、黄瓜、草莓等植物单性结实。

2.5 抗逆作用

生长素在植物生根中起中心作用，很多诱发生根因子都是通过生长素起作用的。体外施加生长素可促进不定根和侧根的生长发育，且内源生长素含量升高的转基因或突变植株均表现出侧根增加，抗旱能力增强。转iaaM基因的转基因烟草根系发达、含水量高、保水能力强、耐热性和抗旱性强。吴忠义研究表明外源IAAM/AtCKX3基因在玉米的根中特异性表达，促进了根系的生长发育，从而提高了玉米的抗旱性，且转基因株系在正常浇水条件下的生长发育没有受到抑制。该研宄说明促进根系的生长发育才是提高植物抗旱性的关键有效途径，为抗旱新种质材料创制提供了一个新的思路。

特定启动子调控下的iaaM基因表达引起的单性结实，在不利于授粉的条件下也能保持产量的稳定，因而转iaaM基因的单性结实作物本身就具有一定的抗逆能力。Rotino GL等实验结果表明转iaaM基因的番茄在花期、座果期出现显著高温， 仍然保持了相当高的产量，单果数增加。Rotino GL等获得的转基因茄子在寒冷的冬季也能正常坐果。

除此之外，赵丽红研究发现iaaM和ACC脱氨基酶基因的协同表达可提高植物对重金属的吸收和组织中中金属的含量，还有研究发现把iaaM基因转化根际微生物，iaaM基因表达的产物能促进其寄生植物的抗旱性和抗病原菌能力。

3 展望

近年来，随着分子生物学的迅猛发展，基因工程技术广泛地应用于植物的遗传与改良，大力推动了生长素和iaaM基因在植物基因工程的研究与应用，但解析植物中生长素的合成代谢与器官发生发育过程的关系还需进一步探讨，对于转iaaM基因的植株中生长素与其它激素相互作用机制以及激素对植物生长发育的作用还需进一步探究，大部分转iaaM基因的研究还处于转化阶段，对转基因植物的生理方面还有待在细胞水平和分子水平进行深入研究。随着更多优良特异启动子的发现，利用iaaM基因将培育出更多产量高和品质优的作物新品种。

参考文献：

[1]Di WD，Zhang CG，Luo P，et al.The biosynthesis of auxin：how many paths truly lead to IAA？[J].Plant Growth Regul，2015：1-11.

[2]Schroder G，Waffenschmidt S，Weiler EW，et al.The region of Ti plasmids codes for an enzyme synthesizing indole-3-aceic acid[J].Eur J Biochem， 1984，138：387-391.

[3]李朝霞，殷娴，江一希，等，转基因烟草中过量生长素对叶片生长发育的影响[J].2013，49（4）：369-373.

[4]荆风雪.iaaM基因转化黄花蒿及其对腺毛发育的影响[D].湖南农业大学，2013.

[5]彭彦，王亚红，黄丽华，等.植物生长素合成酶iaaM基因在烟草韧皮部的特异表达对其发育的影响[J].湖南农业大学学报，2012，38（1）32-35.

[6]Bavrina TV，Milyaeva EL，Machácková I，et al.Effect of Phytohormone Biosynthesis Genes （ipt and iaaM+iaaH） on the Sexual Reproduction of Transgenic Tobacco Plants[J].Russian Journal of Plant Physiology，2002，49（4）：484-491.

[7]Alekseeva VV，Rukavtsova EB，Bobreshova ME，et al.Production and Analysis of Tobacco Transgenic Plants Expressing the Agrobacterial Gene for Tryptophan Monooxygenase[J].Russian Journal of Plant Physiology，2004，51（51）：541-546.

[8]Zhang M，Zheng X，Song S，et al.Spatiotemporal manipulation of auxin biosynthesis in cotton ovule epidermal cells enhances fiber yield and quality[J].Nature Biotechnol，2011，29：453-458.

[9]Mezzetti B，Landi L，Pandolfini T，et al.The defH9-iaaM auxin-synthesizing gene increases plant fecundity and fruit production in strawberry and raspberry[J].Bmc Biotechnology，2004，4（1）：1-10.

[10]文秀红.植物激素合成酶基因ipt，iaaM及其双价基因转入甘蓝型油菜对其产量性状的影响[D].西南农业大学，2003.

[11]Hannele T，Laurence P，Sharon R，et al.Cambial-Region-Specific Expression of the Agrobacterium iaa Genes in Transgenic Aspen Visualized by a Linked uidaA Reporter Gene[J].Plant Physiol，2000，23（2）：531-542.

[12]Sharon R，Vronica B，Hannele T，et al.Accurate and high resolution in situ hybridization analysis of gene expression in secondary stem tissues[J].The Plant Journal，1999，19（3）：363-369.

[13]刘春明，刘林德，姚敦义，等.Ti质粒的基因1，2对胶烟草体细胞胚发生的诱导作用[J].实验生物学报，1990，23：1-9.

[14]Zheng X，Deng W，Luo K，et al.The cauliflower mosaic virus （CaMV） 35S promoter sequence alters the level and patterns of activity of adjacent tissue- and organ-specific gene promoters[J].Plant Cell Rep.2007 Aug；26（8）：1195-1203.

[15]Alida Ballester，Magdalena Cervera，Leandro Pea.Evaluation of selection strategies alternative to nptII in genetic transformation of citrus[J].Plant Cell Reports，2008，27（6）：1005-1015.