秦 霞，刘 红，任晓燕，柴翠元

(淮南联合大学 化工系，安徽 淮南 232038)

应用亚临界水技术对枇杷叶中熊果酸的提取工艺优化研究

秦 霞，刘 红，任晓燕，柴翠元

(淮南联合大学 化工系，安徽 淮南 232038)

因实用的药用价值，熊果酸的亚临界水萃取技术受到相关研究者的关注。为有效提高熊果酸的提取率，以亚临界水萃取过程中的萃取时间、萃取温度、溶剂流速和系统压力为可变因素，通过设计正交试验及应用高效液相色谱对熊果酸进行定量测定，最终确定最佳的提取工艺：原料的粒径60目、提取温度 200 ℃、 提取时间75 min、 系统压力 15 MPa，提取率达到 70.09%。亚临界水萃取方法不仅提高熊果酸的提取率，还是一种新型的绿色萃取技术，具有良好的发展前景。

亚临界水提取；枇杷叶；熊果酸；高效液相色谱

有关研究表明，熊果酸具有消炎抗菌、降血脂及血糖、抗氧化、抗肿瘤等医药作用，熊果酸作为枇杷叶中存在的天然成分之一，因其多种药理作用及较低的含量，各研究者对其提取工艺的研究越来越深刻[1]。由于传统常用的溶剂提取法存在提取耗费时间过长、目标物产品质量较差、溶剂残留严重，且会对环境产生一定的危害与污染等一些问题，使亚临界水提取技术受到了广泛的关注。亚临界水又称为高温水，是在一定的压力下，通过加热将水温升高至100～374℃，但水仍保持液体状态[2]。高温高压条件下，液体水的微观结构、物理特性、化学特性均发生了很大的变化，水的极性增强，进而对有机物的溶解性提高。亚临界水的这些特性使其成为一种绿色环保的提取技术，在国际上有着良好的发展前景[3]。高温高压下亚临界水提取技术工艺过程会因提取原料与目标物的不同而产生较大差异[4]。由于熊果酸巨大的医药实用价值，本文以枇杷叶为天然的原料，以枇杷叶的粉碎程度粒径、提取温度、提取时间、提取压力为可变因素，设计正交试验，最后通过高效液相色谱技术对熊果酸进行定量研究，确定亚临界水技术对熊果酸提取的最佳工艺。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料与设备

枇杷叶(深圳市现代中药科技公司)；超纯水(实验室自制)；熊果酸标液(纯度≥98%)；乙醇(上海方野化工有限公司，优级纯)；亚临界水提取装置(实验室自制)；高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；AL2002电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；旋转蒸发仪(郑州巴立科技有限公司)；Prominence LC-20A HPLC高效液相色谱系统(日本岛津公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 采用亚临界水提取技术提取枇杷叶中的熊果酸

以质量较好的枇杷叶为原料，枇杷叶的粒径、提取温度、提取时间、提取压力为可变因素，设计正交试验(L9(34))，根据正交设计方法按表安排试验。选取质量、外观大致相同的枇杷叶，分别将其粉碎为粒径20目、40目、60目、80目的粉末，放入提取柱中，通过压力泵将去离子水放入预热器中进行加热， 在分别达到预定的提取温度100 ℃、150 ℃、200 ℃、250 ℃时，去离子水进入提取柱中，待系统压力分别达到设定值(5 MPa、10 MPa、15 MPa、20 MPa)时，开始对提取时间进行计时，萃取至设定的时间(45 min、60 min、75 min、90 min)时，将熊果酸提取液进行冷却收集[5]。

1.2.2 高效液相色谱条件和提取液中熊果酸含量的测定

1)色谱条件：SHISEIDO C-18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；体积比为85∶15∶0.05的乙腈-水磷酸流动相；1.0 mL/min的流速；210 nm的检测波长；30 ℃柱温。

2)原料溶液的制备：准确称量枇杷叶10 g，用乙醇作为溶剂对熊果酸进行萃取，料液比1∶12，经回流萃取2 h，过滤，重复操作，滤渣用乙醇超声辅助提取30 min，将两种提取液合并,并用旋转蒸发器蒸干，用乙醇定容至250 mL，摇匀并用0.45 μm的微孔滤膜过滤，设置样品的进样量为10 μL，通过高效液相色谱测定得到熊果酸含量为1.038%。

3)应用高效液相色谱技术对各个实验所得到的提取液中的含量进行测定，并计算熊果酸的提取率S。提取率S(%) =提取液中熊果酸的量/(原料质量×原料中熊果酸含量)×100[6-9]。

2 结果与分析

2.1 原料粉碎度(粒径)对提取率的影响

用粉碎机将枇杷叶粉碎后分别过20目、40目、60目、80目筛，每份为10 g，将其放入提取柱中，分别采用10 MPa的提取压力、90 min的提取时间、200 ℃的提取温度，应用实验室自制的亚临界水提取设备，对枇杷叶中的熊果酸进行提取，应用高效液相色谱分析法，对提取液中的熊果酸含量进行测定，并计算熊果酸的提取率，进行绘图。

由图1所示，在枇杷叶粒径分别为20目、40目、60目、80目的条件下,采用亚临界水提取技术提取所得的熊果酸含量随着粒径的减小而逐渐升高，当枇杷叶粒径超过60目以后，熊果酸的提取率又呈现降低的趋势，在粒径为60目时，熊果酸的提取率达到最高。在一定的范围内，枇杷叶中熊果酸的提取率随着枇杷叶破碎度的增大而提高，但是当破碎度大于60目时，熊果酸提取率又出现下降的趋势，熊果酸存在于植物组织细胞中，植物组织的粉碎度对植物细胞的破壁有较大程度的影响，当细胞的破壁率处于较高的水平时，细胞中存在的熊果酸才易被提取出来。另外，枇杷叶的破碎度越高，其组织总面积就越大，熊果酸则越容易从枇杷叶内部扩散出来。但是，当枇杷叶的破碎度达到一定程度时，熊果酸的提取率反而会有所下降。这主要是因为，枇杷叶粒径过小时会比较容易形成“冲团”现象，进而降低了熊果酸的提取率。

图1 不同枇杷叶粒径对熊果酸提取率影响

2.2 提取温度对提取率的影响

使用亚临界水萃取装置对枇杷叶中熊果酸进行萃取，将系统压力设为10 MPa；萃取时间为90 min；原料粒径60目，设定萃取温度分别为100 ℃、150 ℃、200 ℃、250 ℃，对目标物进行萃取，并通过高效液相色谱测定熊果酸的含量，计算提取率，进而绘图分析。

图2表明，当提取温度在200 ℃之前， 熊果酸的提取率会随着提取温度的升高明显提高，当提取温度100 ℃时，仅仅有少量的熊果酸被提取出来，提取率达到28%，当温度到达200 ℃后，熊果酸的提取率高达57.20%。但是随着温度的进一步升高，可以闻到明显的枇杷叶子的焦糊味，而熊果酸的提取率也随之明显下降。提取温度作为影响枇杷叶中熊果酸提取率的关键性因素，对于提取效果、提取速度等均有较大的影响。水的极性随水温升高而下降，溶解性增强，因此，通过提取温度控制可以控制提取溶剂的极性，影响熊果酸的提取率。但是，当温度过高时会对枇杷叶原料产生一定的破坏作用，叶子出现明显的焦糊味道，进而使枇杷叶中的熊果酸遭到破坏，严重影响到熊果酸的提取率，因此，应当将200 ℃作为枇杷叶熊果酸的萃取最佳温度。

图2 提取温度对熊果酸提取率的影响分布

2.3 系统压力对枇杷叶中熊果酸提取率的影响

应用实验室自制的亚临界水提取装置，设定熊果酸提取的温度为200 ℃；粉碎的枇杷叶粒径为60目；提取时间为90 min；分别设置系统的压力为5 MPa、10 MPa、15 MPa、20 MPa，对枇杷叶中的熊果酸进行提取，并根据提取率的变化进行绘图，分析系统压力对枇杷叶中熊果酸提取率的影响。

由图3可见，系统压力的变化对熊果酸提取率的影响相对较小，随着系统压力的提高，熊果酸的提取率虽然有较小程度的提高，但是在系统压力到达15 MPa以后，熊果酸的提取率又略有降低。在亚临界水萃取过程中，系统压力的主要作用是保证去离子水在高温状态下仍旧可以保持液体状态，随着系统压力的增大，枇杷叶中的熊果酸更好地析出，水的密度亦会增大，溶解能力增强，有效成分传质速率会相应加快。但在系统压力升高到一定值之后，也会在一定程度上使原料中溶出更多的其他杂质，进而影响熊果酸的溶出，另外，从本实验室的条件考虑，压力的进一步增大也会对实验室设备提出更高的要求，因此，应选择15 MPa作为最佳的枇杷叶熊果酸提取压力。

图3 系统压力对熊果酸提取率的影响

2.4 提取时间对枇杷叶中熊果酸提取率的影响

应用亚临界水提取装置，设定熊果酸提取的温度为200 ℃；粉碎的枇杷叶粒径为60目；系统压力为10 MPa；分别设置提取时间为45 min、60 min、75 min、90 min，对枇杷叶中的熊果酸进行提取，并根据提取率的变化进行绘图。

由图4可见，在提取时间未超过75 min之前，枇杷叶中熊果酸的提取率会随着提取时间的延长有所提高，对枇杷叶中熊果酸的提取更加充分。但是，在提取时间超过75 min之后，枇杷叶中熊果酸的提取率却随着萃取时间的延长而略有降低。应用亚临界水对枇杷叶中熊果酸的提取过程是一个目标物扩散至提取溶剂中至二者平衡的动态过程，如果在平衡前适当延长熊果酸的提取时间，则会利于熊果酸的进一步析出，但是在平衡之后，整个提取溶液达到了饱和状态之后，熊果酸却不会再有效析出，反而会在高温高压的条件下，使熊果酸得到降解，降低其提取率。所以适当的提取时间才能获得较高的提取率。图4显示，当提取时间为75 min时，枇杷叶中熊果酸的提取率达到最高。

图4 提取时间对熊果酸提取率的影响

2.5 枇杷叶中熊果酸的最佳提取工艺

在以上枇杷叶粒径大小、萃取温度、系统压力与萃取提取时间各单因素试验的基础上，选取粉碎度、提取温度、系统压力、提取时间这4个因素进行正交试验，以熊果酸总得率为评价指标。因素水平安排见表1，采用四因素三水平即正交试验方法找出枇杷叶熊果酸亚临界水提取的最佳工艺参数。

表1 枇杷叶中熊果酸提取的正交试验设计

按照正交试验设计方案的工艺条件进行枇杷叶熊果酸的亚临界提取试验，并分别利用高效液相色谱分析法测定枇杷叶熊果酸的提取率，结果见表2。

表2 亚临界水提取枇杷叶熊果酸正交试验结果

由表2的极差可知：4个因素对枇杷叶熊果酸提取率的影响顺序依次为提取温度>提取时间>系统压力>枇杷叶粉碎度。表2中1～9项所有试验中，3号实验A1B3C3D3萃取工艺熊果酸的提取率最佳，而研究分析所得的最佳提取实验条件为A3B3C3D3，因为其并不在该正交试验中，因此,做一次验证实验，得出该条件下枇杷叶中熊果酸的提取率为72.09%，进而验证了上述结论的正确性。最终确定枇杷叶熊果酸的亚临界水萃取最佳工艺因素组合为：粒径60目、提取温度200 ℃、系统压力15 MPa、提取时间75 min时，枇杷叶的熊果酸提取率最高。

3 结束语

应用亚临界水提取枇杷叶中的熊果酸作为一个连续的动态过程，原料的粉碎度、萃取温度、系统压力和萃取时间都会对熊果酸提取效果产生不同程度的影响，通过本实验，应用亚临界水萃取技术提取枇杷叶中熊果酸的最优工艺条件为：枇杷叶粒径60目、提取温度200 ℃、系统压力15 MPa、提取时间75 min，该条件下枇杷叶中熊果酸的提取率为72.09%。目前，我国通常采用溶剂提取法对熊果酸进行提取，但是该提取方法存在的问题较多，比如提取液的产品质量较差、溶剂残留严重、提取所用的溶剂较多、容易产生环境污染等问题，尽管近些年出现了一些诸如微波、超声等辅助的办法，使枇杷叶中熊果酸的提取率得到了一些提高，缩短了提取的时间，但是却没有能从根源上解决问题，亚临界水技术作为一种绿色环保的新型萃取技术，具有较好的发展前景。

[1] 于金召，曾茂茂，何志勇，等.亚临界水提取枇杷叶中熊果酸的工艺优化[J].食品工业科技，2013(13)：189-192.

[2] 陈赟，李建明，章丽娟.亚临界水萃取技术及其在天然产物分析中的应用[J].中草药，2009， 32(4) :636-641.[3] 努尔皮达·阿卜拉江，其买古丽·阿沙木，迪丽努尔·马里克.野蔷薇根中熊果酸的提取工艺研究[J].中国酿造，2012,31(12)：41-43.

[4] 任秀莲，钟世安，魏琦峰.苦丁茶中熊果酸的提取工艺[J] .中南大学学报， 2004， 35(1) :70-74.

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[8] 郭娟，丘泰球，杨日福.亚临界水萃取技术在天然产物提取中的研究进展[J].现代化工， 2007，2(12) :19-22.

[9] 孟煜嘉，王艳妮，徐逸凡，等.熊果酸的提取、分离及分析方法的研究进展探析[J].工艺与装备，2016(2)：45-51.

[责任编辑：郝丽英]

Optimization research of extraction process of ursolic acid from loquat leaf with subcritical water technology

QIN Xia1,LIU Hong2,REN Xiaoyan3,CHAI Cuiyuan4

(Department of Chemistry, Huainan United University,Huainan 232038,China)

The subcritical water extraction technology of bear acid is concerned by the researchers because of its practical medicinal value. In order to improve the extraction rate of the ursolic acid, this paper takes extraction time, extraction temperature, solvent flow rate and system pressure in the process of subcritical water extraction as variable factors, by designing orthogonal test and using high performance liquid chromatography to quantitative analysis ursolic acid, and finally determines the best extraction process: particle size 60 mesh of raw material, extraction temperature of 200 ℃, extraction time of 75 min, system pressure of 15 MPa, and extraction rate reached 70.09%. The subcritical water extraction method not only improves the extraction rate of the ursolic acid, but also serves as a new green extraction technology with development prospects.

subcritical water extraction; loquat leaf; ursolic acid; high performance liquid chromatography

10.19352/j.cnki.issn1671-4679.2016.06.010

2016-07-22

安徽高校省级自然科学研究项目(KJ2014A235);2014安徽省高校优秀青年人才支持计划，安徽省高校青年人才基金重点项目(2013SQRL139ZD);高校省级自然科学研究重点项目(KJ2015A430，KJ2016A655)

秦 霞(1976-)，女，副教授，研究方向：天然产物化学.

O636

A

1671-4679(2016)06-0041-04