比较两种ELISA试剂盒在猪伪狂犬病血清抗体检测中的一致性

2016-12-27全炎铭贾泽颖郭又春刘修权刘莉如伊秀春陈华林

中国猪业 2016年12期

关键词：狂犬病一致性猪场

全炎铭贾泽颖刘邓郭又春刘修权刘莉如伊秀春陈华林

（北京三元集团畜牧兽医总站，北京 100192）

比较两种ELISA试剂盒在猪伪狂犬病血清抗体检测中的一致性

全炎铭贾泽颖刘邓郭又春刘修权刘莉如伊秀春陈华林

（北京三元集团畜牧兽医总站，北京 100192）

比较两种ELISA试剂盒检测结果的一致性，为流行病学调查和临床诊断筛选适合的商品化试剂盒。采用来自两个厂家的野毒抗体（gE）和免疫抗体（gB）ELISA检测试剂盒分别检测362份和392份猪血清，应用Kappa检验比较试验数据的一致性。结果显示：两种猪伪狂犬病抗体（gE）检测试剂盒联合检测出95份抗体阳性和256份阴性，符合率97.24%，结果一致性为极强（Kappa值0.932）；两种猪伪狂犬病抗体（gB）检测试剂盒联合检测出351份抗体阳性和9份阴性，符合率91.84%，一致性为弱（Kappa值0.347）。以上结果说明，两种猪伪狂犬病抗体（gE）检测试剂盒都适用于PRV gE抗体检测，而两种猪伪狂犬病抗体（gB）检测试剂盒差异较大，需慎重选择。

猪伪狂犬病；ELISA试剂盒；比较；Kappa检验

伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一种急性传染病，其特征为发热、奇痒及脑膜炎症状[1-2]。该病曾得到很好的控制，但2011年至今，从北方向南方，PR疫情再次抬头，席卷我国大部分地区，许多免疫过基因缺失苗的规模化阴性猪场瞬间转阳，很多研究[3-6]表明此次大面积的猪场发病是由变异的PRV引起。虽然近期该病看似得到控制，很多野毒感染阳性稳定场很少发病，仅出现混合感染病例，但是在种猪场各个生长阶段的猪群野毒感染的高阳性率，很大程度上影响了国内养猪业持续发展，增加了疫病防控的复杂性[7-9]，同时PR野毒感染率居高不下，存在疫情暴发的风险。因此，为了保证被检猪群的安全性和加快阳性猪场的野毒净化措施，有效开展野毒感染抗体与免疫抗体水平的跟踪监测显得十分重要[7-8]。

病毒抗体监测的方法较多，其中酶联免疫吸附试验（ELISA）具有客观、敏感、特异、快捷等优点，为国际贸易中抗体检测指定方法之一，目前已经广泛运用于临床诊断和血清学调查中[10-12]。本研究通过比较国内运用较为广泛的两种进口PR病毒野毒抗体gE和gB抗体ELISA检测试剂盒，检测样本来源清晰的PR阳性猪场和阴性猪场血清，对其检测结果的一致性进行评估和分析，为合理选择诊断试剂盒提供参考。

1 材料与方法

1.1检测样品

猪血清采自9个不同的规模化猪场（阳性猪场3个，阴性猪场6个），为本实验室保

存的秋季抽检血清样本。选取392份生长阶段清晰的血清样本进行免疫抗体检测(除25～30日龄哺乳仔猪外，其他均免疫过PRV gE基因缺失弱毒苗)，再从这392份血清中剔除PR阴性场（A猪场）30份血清进行野毒抗体检测。

1.2检测试剂

ELISA进口试剂盒分别购买于美国爱德士（IDEXX）公司和西班牙海博莱（HIPRA）公司。PRV-gpI（gE）抗体检测试剂盒：IDEXX（批号为99-09836 FM349），HIPRA（批号为 CAE.IM90）；gB抗体检测试剂盒：IDEXX（批号为99-09732 EM176），HIPRA（批号为FS6397）。

1.3检测方法及结果判定

猪伪狂犬病病毒gE抗体检测方法均按试剂盒说明书进行。IDEXX：读取OD650值，用S/N值来判定结果（S/N=样品OD值/阴性对照平均OD值），其中S/N≤0.6判为阳性，S/N＞0.7为阴性，0.6＜S/N≤0.7为可疑；HIPRA：读取OD450值，采用IN%值判定（IN%=（阴性对照平均OD值-样品OD值）/阴性对照平均OD值*100%），其中IN%＞45为阳性，IN%＜40为阴性，40≤IN%≤45为可疑。

猪伪狂犬病病毒gB抗体检测方法也按试剂盒说明书进行。IDEXX：读取OD650值，用S/N值来判定结果，其中S/N≤0.5为阳性，S/N＞0.6为阴性，0.5＜S/N≤0.6为可疑；HIPRA：测定OD405值并计算S/P值，S/P= (样品OD值-阴性对照平均OD值）/（阳性对照平均OD值-阴性对照平均OD值），其中S/P≥0.5为阳性，S/P＜0.5为阴性。

如有结果差异，选取两试剂盒检测结果不一致的血清样本，再检测1次，取2次平均OD值作为最终结果判定。

1.4统计学方法和判定指标

采用EXCEL处理数据，使用SPSS 19.0统计软件对两种试剂盒检测结果进行分析。应用Kappa检验判定一致性，其中Kappa值＜0，提示一致性极差；Kappa值在0～0.2，表示一致性微弱；Kappa值在0.21～0.4，一致性弱；Kappa值在0.41～0.6，中度一致；Kappa值在0.61～0.80，较高一致性；Kappa值＞0.80，极强一致性。通过符合率、Kappa值等统计学指标，并结合送检猪场流行病学情况综合评价试验检测结果。

2 结果

2.1 Kappa检验比较猪伪狂犬病病毒gE抗体检测试剂盒

采用两种试剂盒检测结果见表1，总体样品结果的符合率为97.24%。根据Kappa一致性检验，Kappa值为0.932，表明两种试剂盒检测结果有极强的一致性。

表1 两种gE抗体试剂盒检测结果一致性分析（份）

两种猪伪狂犬病病毒gpI（gE）抗体检测结果显示，362份样品中有10份样品结果不一致，分析发现这10份血清样品的IDEXX检测结果S/N值都是介于0.4～0.7之间，且分别来源于1份种公猪样品（B033-1），1份哺乳仔猪样品（B033-P5），1份母猪样品（B036-8）和7份育成育肥猪样品。不相符合猪血清样品检测结果见表2。

表2 两种gE抗体试剂盒检测不相符合血清样品结果比较

2.2 Kappa检验比较猪伪狂犬病病毒gB抗体检测试剂盒

猪伪狂犬病病毒gB抗体检测试剂盒检测结果见表3，总体样品检测结果的符合率为91.84%。Kappa值为0.347，判定结果为弱，表明两种产品检测结果存在较弱的一致性。

表3 两种gB抗体试剂盒检测结果一致性分析（份）

两种gB ELISA试剂盒检测结果可见，392份猪血清样品中，有33份样品结果不一致，分析检测差异主要集中在育成育肥猪群（中大猪），4份育仔猪。参考送检猪场的送样信息可看出,用这两种试剂盒检测PR阴性场和阳性场一部分中大猪血清样品出现了明显差异，见表4。

3 分析与讨论

Kappa统计量是Cohen在1960年首先提出的一种旨在校正机遇可能后衡量一致性的方法，也是一种用于检验分类变量资料的一致性和重现性的统计指标[13]。具体而言，在研究工作中，可用来检验比较两种检查或测定方法结果的一致性，以及评估临床诊断结果或调查结果的重现性问题[14]。近几年来，该方法在检验医学研究、流行病学及临床资料可靠性考察衡量方面的应用越来越广泛[14-16]，但在兽医实验室检测中较少。随着国家对一些重大动物疫病防控的高度重视，在强制免疫成为防疫的关键一环后，临床诊断和抗体跟踪监测显得尤为重要，于是市面上很多兽医临床诊断试剂盒，如雨后春笋不断涌现，可以应用Kappa一致性检验对其进行比较和评估[10-12,17]。

猪伪狂犬病的防治主要依靠疫苗接种和常规诊断检测，猪PR病毒野毒抗体检测采用gE抗体检测试剂盒，诊断猪群是否感染猪伪狂犬病野毒株。PRV gE和gB抗体检测试剂盒可用于PR诊断和该病的综合防治及PR净化效果的评估。本研究根据Kappa值为0.932这个判定指标，表明两个厂家gE-ELISA试剂盒一致性极强，说明两种试剂盒在血清学诊断和监测中差异不显著，均可用于临床个体样本和群体野毒抗体检测，这与杨涛等[17]报道的基本一致。

表4 两种gB抗体试剂盒检测不相符合血清样品结果比较

在规模化猪场猪群PRV gE野毒抗体检测的同时，采用gB抗体检测试剂盒对猪群免疫后产生的抗体水平进行检测，能更好地反映猪群PR防疫水平和抵制强毒感染的能力。通过我们对北京部分规模化养殖猪场PR的摸底排查和持续的跟踪监测，了解到目前猪场普遍使用PRV gE基因缺失弱毒苗防控PR，近一两年内出现很多PR阳性稳定场，全群受野毒侵蚀，后备猪群表现高的阳性率，是母猪群阳性率居高不下，其猪群中隐性感染的猪只随之进入后备群，在猪场中形成循环感染，造成PR难以净化的重要原因。但是出现的猪群免疫后持续性抗体水平（gB抗体高达95%以上）这种奇怪的现象引人深思，而本研究通过比较两种gB抗体检测试剂盒，检测结果差异较大，一致性为弱，提示两种试剂盒至少有一种结果不可靠，对两者检测结果存在差异的33份猪血清进行分析不难看出，主要集中在中大猪的检测样本中，HIPRA-gB ELISA结果检出阴性，符合当前猪场中大猪群抗体低,容易感染的实际背景。表明不管是PR阴性场还是PR阳性场部分中大猪群免疫抗体水平低，加上卫生环境差，容易激发混合感染而发病，有必要加强育成育肥猪舍的日常消毒卫生和生物安全工作。因此建议在开展PR免疫后gB抗体检测时，应根据实验室检测群体来源和检测对象，慎重选择不同的诊断试剂盒[10,12]。

当然，根据实际检测样本计算的Kappa值仅仅只是一个样本的统计量，是反映一致性程度的数值[10]，体现两种检查方法或试剂检测的一致性水平，可作为可靠性参考，但不是判定试剂盒或方法好坏优劣的唯一性指标，还需要参考敏感性、特异性和稳定性等指标[11-12]，以及抽样误差和实验检测中不可控的其他影响因素。

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