杨 洋,孙文基,张 锦,周田妹,马岑,朱忠良,翟西峰,张勇民

(1.西北大学 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室,陕西 西安 710069;2.西北大学 陕西省生物医药重点实验室,陕西 西安 710069/法国巴黎第六大学分子化学研究所, 巴黎 75005;3.西安医学院, 陕西 西安 710021)



·生命科学·

秦艽不同提取物中3种环烯醚萜苷的含量测定

杨 洋1,2,孙文基1,2,张 锦3,周田妹3,马岑3,朱忠良1,2,翟西峰3,张勇民1,2

(1.西北大学 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室,陕西 西安 710069;2.西北大学 陕西省生物医药重点实验室,陕西 西安 710069/法国巴黎第六大学分子化学研究所, 巴黎 75005;3.西安医学院, 陕西 西安 710021)

测定陕西陇县和凤县地区10批秦艽药材水提取物和80%乙醇提取物中龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷3种活性成分的含量。采用HPLC-ELSD法,Hedera C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm) 色谱柱,以甲醇-0.5 %乙酸为流动相,进行梯度洗脱分离检测。结果显示 80%乙醇提取的提取物量高于水提取的提取物量,以及醇提取物中龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的含量都比水提取物中的含量高,并且提取物中这3种活性成分以龙胆苦苷含量最高,落干酸次之,獐牙菜苦苷含量较低。表明通过80%的乙醇对秦艽药材中化学成分提取的效果优于水提取。

秦艽;含量测定;HPLC-ELSD;水;80%乙醇

秦艽(GentianamacrophyllaPall)为龙胆科龙胆属多年生草本植物,是我国传统常用中药之一。秦艽药用部位为根,性平,味苦、辛,具有祛风湿,清湿热,止痹痛的功效,常用于风湿痹痛,中风半身不遂,筋脉拘挛等[1]。现代科学研究发现秦艽具有明显的保肝作用[2]、抗炎作用[3]和降低尿酸的作用[4]。秦艽在我国许多省份均有栽培,但以陕西、甘肃和青海地区所产秦艽为道地药材。秦艽中的主要化学成分为环烯醚萜苷类[5],其中龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷经现代研究发现具有较强和广泛的药理活性。龙胆苦苷具有治疗结肠炎[6],促进肝脏对脂肪的代谢[7],以及保肝利胆[8]等作用;落干酸亦称马钱苷酸,具有治疗动脉粥样硬化的作用[10];獐牙菜苦苷具有保护心肌细胞[11],抑制胆汁淤积性肝损伤肝纤维化[12]和治疗脂肪肝[13-14]等作用。因此,本实验比较了两种不同提取溶剂其提取物中这3种活性成分的含量,进而为陕西秦艽药材中活性成分的研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

10批秦艽药材(2015年10月采挖自陕西省陇县和凤县)。对照品:龙胆苦苷(批号:20140520),落干酸(批号:20140728),獐牙菜苦苷(批号:20140521),均由中国食品药品检定研究院提供。水(双蒸水),95%乙醇(分析纯,天津市海滨科迪化学试剂有限公司),甲醇(色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司),乙酸(分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司)。

1.2 仪 器

高效液相色谱仪(Waters 2694型, Empower色谱工作站),蒸发光散射检测器(Alltech 2000ES型,Alltech公司)。

2 方 法

2.1 色谱条件

色谱柱:Hedera C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm);洗脱条件:甲醇(A)-0.5 %乙酸(B)[15],梯度洗脱:0 ～ 20 min, 20% A ～ 40% A;进样量:5 μL;柱温:25℃;流速:0.8 mL/min;蒸发光散射检测:漂移管温度为90.0℃,载气流速为3.2 L/min;样品采集时间20 min。

2.2 混合对照品溶液制备及线性关系的考察

分别精密称取龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷3种对照品于容量瓶中,用甲醇溶解分别定容至刻度,然后将3种对照品溶液混合制备成混合对照品储备溶液,混合液中龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的浓度分别为3 308.8μg·mL-1,861.6 μg·mL-1,895.5 μg·mL-1。以“2.1节下”色谱条件,按1 μL,2 μL,5 μL,10 μL,20 μL,连续进样5次,所得色谱图如图1A。 记录被测目标化合物色谱峰面积,以峰面积为横坐标,对照品进样量(μg)为纵坐标绘制标准曲线。

2.3 精密度试验

精密吸取“2.2节下”混合对照品储备液5 μL,连续进样6次,记录峰面积积分值,计算结果表明仪器精密度良好,以龙胆苦苷计算RSD为1.31% (n=6)。

2.4 稳定性试验

精密吸取“2.2节下”混合对照品储备液5 μL,每隔3 h进样一次,进样8次,记录峰面积积分值,计算结果表明龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷在24 h内稳定性良好,RSD分别为1.27%,1.05%,1.36% (n=8)。

2.5 重复性试验

精密称取同一批药材粉末,每份药材粉末为10 g,按“2.7节”方法制备秦艽80%乙醇提取物供试品溶液及水提取物供试品溶液各5份。按“2.2节”色谱条件进行测定,记录峰面积积分值,以龙胆苦苷计算2种提取溶剂提取下的RSD值分别为0.9%,0.7%。

2.6 加样回收率实验

精密称取已知龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷含量的药材粉末10 g,精密加入龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷1.0 mg,0.8 mg,0.6 mg,如此平行5份,然后按“2.7节”方法制备80%乙醇提取物供试品溶液。按“2.2节”色谱条件进行测定,计算回收率。同时以相同方法,计算水提取方法下的回收率。结果显示:80%乙醇提取方法下龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷平均回收率分别为 101.5% (RSD=1.73%), 105.6% (RSD=1.80%), 99.6% (RSD=1.67%);水提取方法下龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷平均回收率为 99.6% (RSD=1.73%), 98.8% (RSD=1.80%), 102.3% (RSD=1.67%)。

2.7 供试品溶液制备和测定

药材提取 10批秦艽药材,分别粉碎过100目(150μm)筛,用80%乙醇和水分别提取,其中料液比为1∶10 (100 g/1 000 mL),加热沸腾回流提取各1h,过滤,如此再重复提取2次,合并滤液浓缩得浸膏,将浸膏干燥后,称量并记录数据。

溶液制备及测定 精密称取10批秦艽药材醇提取物和水提取物的干燥浸膏各50 mg于10 mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀,过滤后,以“2.1节下”色谱条件分别进行测定,样品检测色谱图如图1B和图1C。记录峰面积,用外标法计算结果。

3 结果与分析

3.1 3种活性成份的线性方程的建立

根据实验中色谱条件,测得对照品色谱图如图1A,龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的分别在3.3 ～ 66 μg,0.8 ～ 17.2 μg,0.9 ～ 17.9 μg范围内呈良好线性,它们的线性回归方程性、线性范围、相关系数如表1。

表1 3种活性成分的线性回归方程

Tab.2 Linear relationships of three active ingredients

组 分回归方程相关系数R线性范围/μg龙胆苦苷Y=6E⁃06X⁃575430991733～66落干酸Y=6E⁃07X+1260999508～172獐牙菜苦苷Y=1E⁃05X+4E⁃150999809～179

3.2 醇提取物和水提取物中3种活性成分的比较

根据实验中色谱条件,测得秦艽药材80%醇提取物的样品色谱图如图1B,水提取物的样品色谱图如图1C,并根据峰面积,以外标法通过线性方程计算得80%醇提取物和水提取物中龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的含量分别见表2和表3。 从表2和表3中的龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的数据比较,可以发现醇提取物中3种活性成份比水提取中高,且醇提取物的总提取物量高于水提取物。

A 混合标准品,B 80%乙醇提取物,C 水提取物;1 落干酸,2 獐牙菜苦苷,3 龙胆苦苷图1 色谱图Fig.1 Chromatograms

4 讨 论

本实验为了使被检测的目标化合物与相邻的杂质峰得到较好的分离,以及缩短分析时间,对流动相先进行了优化。试验中发现采用ELSD检测,在以甲醇(A)-0.5%乙酸(B)梯度洗脱: 0 ～ 60 min, 20% A ～ 80% A,流速为1 mL/min分离时,龙胆苦苷色谱峰后再无其他明显的色谱峰。但是，峰1和峰2与它们之间的色谱峰分离度差。因此,将流动相条件最终优化成为甲醇(A)-0.5%乙酸(B)梯度洗脱: 0 ～ 20 min,20% A ～ 40% A,流速为0.8 mL/min, 结果被检测目标物与相邻的杂质峰分离良好,而且在相对较短时间即可完成检测。

表2 水提取物中龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的含量(n=2)

Tab.2 Content of gentiopicroside, loganic acid, and swertiamarin in the water extract(n=2)

编号来源(水提)浸膏量/g 龙胆苦苷 落干酸 獐牙菜苦苷 浸膏中含量/%RSD%浸膏中含量/%RSD%浸膏中含量/%RSD%1凤县南星镇寺沟村364628700545410132640272陇县关山草原361026910647010212570423凤县三岔镇孔家庄村334027300495650342950314陇县东风镇峪头村35372674056857017283045凤县三岔镇苇子坪村327128670246120642800436陇县曹家湾镇曹家山村313533440557120533270437凤县三岔镇三官殿村320926190674930141860138陇县八渡镇桃园村387532660836400372900219陇县八渡镇西坡村3812229105893304326103410凤县三岔镇酒铺村3661277404752203422104

表3 80%醇提取物中龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的含量(n=2)

Tab.3 Content of gentiopicroside, loganic acid, and swertiamarin in the 80% ethanol extract(n=2)

编号来源(醇提)浸膏量/g 龙胆苦苷 落干酸 獐牙菜苦苷 浸膏中含量/%RSD%浸膏中含量/%RSD%浸膏中含量/%RSD%1凤县南星镇寺沟村400330600426250232720212陇县关山草原439129160357910312670373凤县三岔镇孔家庄村388528990286240213460414陇县东凤镇峪头村3918322004797704342043

续表3

编号来源(醇提)浸膏量/g 龙胆苦苷 落干酸 獐牙菜苦苷 浸膏中含量/%RSD%浸膏中含量/%RSD%浸膏中含量/%RSD%5凤县三岔镇苇子坪村358829670339720393380376陇县曹家湾镇曹家山村362735370437460123840587凤县三岔镇三官殿村436527170235640342050478陇县八渡镇桃园村439435850639140273350349陇县八渡镇西坡村4219400405395302937102910凤县三岔镇酒铺村42192866037923019272034

实验比较了80%乙醇和水提取下,它们总提取物的量和提取物中龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的含量,同时也比较分析了两种提取溶剂对这3种化合物提取的效果,并且对结果的差异性进行了两样本独立性检验中的曼-惠特尼U检验,结果发现80%乙醇提取物的量明显高于水提取的量,80%乙醇对龙胆苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的提取效果明显优于水的提取效果,而且这3种活性成分在80%乙醇提取物中的比例明显高于水提取物中,且都存在显著性差异(P≤ 0.05)。因此通过本实验发现80%乙醇对秦艽药材的提取效果优于水提取。

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(编 辑 陈镱文)

Simultaneous determination of three iridoid glycosides in the different extract ofGentianamacrophyllaPall

YANG Yang1,2, SUN Wenji1,2, ZHANG Jin3, ZHOU Tianmei3, MA Cen3,ZHU Zhongliang1,2, ZHAI Xifeng3, ZHANG Yongmin1,2

(1. Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China of Ministry of Education,Northwest University,Xi′an 710069, China; 2.Biomedicine Key Lab. of Shaanxi Province, Northwest University, Xi′an 710069,China/Institut Parisien de Chimie Moléculaire, CNRS UMR 8232, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, 4 Place Jussieu, 75005 Paris, France; 3.Xi′an Medical College, Xi′an 710021, China)

GentianamacrophyllaPallwas purchased from Longxian County in Shaanxi Province. This study aimed at determining the content of gentiopicroside, loganic acid, and swertiamarin in this herb water extract and 80% ethanol extract. The contents of gentiopicroside, loganic acid, and swertiamarin in the two extracts were determined by HPLC-ELSD equipped with a Hedera C18 (250 mm×4.6 mm, 5 microns) chromatographic column using a gradient elution with 0.5 % acetic acid and methanol. The results showed that the 80% ethanol total extract was higher than the water total extract, and the three kinds of active ingredient content in ethanol extract were higher than the water extract. In addition, the content of gentiopicroside was the highest, loganic acid was second and swertiamarin was the lowest. The study indicated that 80% ethanol as the extract solution ofGentianamacrophyllaPallwas better than water.

GentianamacrophyllaPall; Determination; HPLC-ELSD; Water; 80% ethanol

2016-03-11

陕西省“百人计划”专家基金资助项目; 陕西省自然科学基金资助项目 (2014JM4125)；陕西省科学技术研究发展计划基金资助项目(2015SF2-06 )

杨洋，男，陕西汉中人，西北大学博士生，从事中药药物化学研究。

张勇民，男，法国巴黎人，西北大学特聘教授，从事药物化学研究。

R248.1

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-06-014