闫 斌, 哈斯鲁, 买合木提·亚库甫, 侯彦杰,徐 超, 伊力哈木·托合提

(新疆医科大学第二附属医院, 新疆 乌鲁木齐, 830063)



缺血预处理在肢体再灌注损伤中的保护作用及一氧化氮、内皮素1的变化

闫 斌, 哈斯鲁, 买合木提·亚库甫, 侯彦杰,徐 超, 伊力哈木·托合提

(新疆医科大学第二附属医院, 新疆 乌鲁木齐, 830063)

目的 分析无创性肢体缺血预处理(IPC)对肢体缺血再灌注损伤的干预效果以及NO和ET-1的变化。方法 30只大鼠随机均分为对照组和实验组，对照组未经过缺血预处理，直接止血2、3、4 h; 实验组经过缺血预处理后，于第2天分别止血2、3、4 h。依次于恢复肢体血流(再灌注)后1、3、7、14 d时抽取血液检测ET-1、NO的水平。结果 大鼠体内NO和ET-1在第1、3、7、14天内呈先递增后递减的趋势，实验组NO在第3天缺血4 h时达最大值，对照组NO在第7天缺血2 h时达高峰；实验组ET-1在第7天缺血3h时达最大值，对照组ET-1在第3天4 h时达最大值，差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组NO在大鼠血液中第1、3、7天的含量在缺血2 h和3 h时均显著低于对照组(P<0.01); 第14天时，仅缺血2 h时显著低于对照组(P<0.01); 实验组ET-1在大鼠血液中第1、3、7天的含量在缺血各时间段时均显著低于对照组(P<0.01); 第14天时，仅缺血3 h时显著低于对照组(P<0.01)。结论 缺血预处理改变了缺血再灌注损伤后血清NO与ET-1的水平。

缺血预处理; 再灌注损伤; 肢体; 一氧化氮、内皮素-1

缺血再灌注可引起全身器官及局部不良反应，即肢体缺血再灌注(LIR)损伤，这种损伤包括缺血期原发性损伤和再灌注期继发性损伤，自由基在再灌注损伤中起着重要作用。缺血预处理是短期缺血应激使机体对随后长时间的缺血再灌注损伤产生明显保护作用的一种适应性机制[1], 可以影响体内的自由基代谢，增强组织对缺血的耐受性。内皮素(ET)和一氧化氮(NO)是血管内皮分泌的血管活性因子，ET是最强烈的缩血管因子，对人体各脏器都有明显的缩血管作用[2]; NO为一种血管舒张因子，在调节血管张力、改善血液循环等方面有着独特的作用[3]。研究[4]显示，大鼠缺血再灌注后发生骨骼肌损伤与机体活性氧产生增多及清除酶活性下降有关，且以再灌注4 h左右为重，NO在再灌注后减轻了LIR损伤，对骨骼肌有保护作用，ET可能通过促进氧自由基的生成和引起中性粒细胞的聚集参与了缺血再灌注后的骨骼肌损伤。本文观察ET和NO在大鼠肢体不同缺血时间的变化以及缺血预处理后的变化，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Rat白细胞介素6 ELisa Kit试剂盒(货号: 201411; 批号: E-30644), Rat 白细胞介素8 ELisa Kit试剂盒(货号: 201411; 批号: E-30581)均购自abcam公司。

1.2 实验动物

健康SD大鼠30只，体质量150～200 g, 雌雄不限；随机分为缺血实验组(实验组)和对照组各15只，每组再分为缺血2、3、4 h小组，每小组5只。

1.3 实验方法

1.3.1 实验组缺血预处理：左后腿脱毛，在大腿根部应用特制的气囊止血带(长12 cm, 宽2 cm), 充气压力为40 kPa, 妥善固定10 min, 造成肢体缺血。充气止血带放气10 min, 形成肢体缺血再灌注预处理过程后，反复3次，于次日再分别持续缺血2、3、4 h; 对照组分别直接持续缺血2、3、4 h。1.3.2 双下肢缺血再灌注模型的制作: 25 mg/kg的戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉，大鼠仰卧，腹部硫化钡脱毛，消毒铺巾，进行无菌手术操作。取下腹正中切口，长约2～3 cm, 切开皮肤、皮下，自中线切开腹部肌肉和腹膜，盐水纱布将肠推向两侧，纵行剪开后腹膜，暴露出腹主动脉和后腔静脉。在腹主动脉分出双侧髂总动脉处以近约1 cm范围内，10倍手术显微镜下仔细分离开腹主动脉和下腔静脉[5]。用显微血管夹阻断腹主动脉血流，可用手指扪及其远端拨动情况予以证实，关腹。4 h后开腹取出血管夹，恢复血流2或24 h。1.3.3 血清NO和ET-1的检测：缺血后放松止血带恢复肢体血流，依次于恢复肢体血流(再灌注)后1、3、7、14 d时抽取血液，取血清标本进行血清NO和ET-1检测，标本置于4℃下, 4 000 r/min离心10 min, 分离血清并置于-80℃冰箱中保存。应用酶联免疫原理检测标本检测NO和ET-1, 严格按照说明书操作。

2 结 果

2.1 不同时间段2组不同处理时间NO和ET-1的变化

无论止血时间长短，大鼠体内NO和ET-1在第1、3、7、14天内呈先递增、后递减的趋势，实验组NO在第3天缺血4 h时达最大值，对照组NO在第7天缺血2 h时达高峰；实验组ET-1在第7天缺血3 h时达最大值，对照组ET-1在第3天4 h时达最大值，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

2.2 2组NO水平和ET-1水平的比较

实验组大鼠血液中NO在第1、3、7天缺血2 h和3 h时的含量均显著低于对照组(P<0.01); 第14天时，仅缺血2 h时显著低于对照组(P<0.01); 其他时点缺血时间各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。实验组大鼠血液中ET-1在第1、3、7天缺血各时间的含量段时均显著低于对照组(P<0.01); 第14天时，仅缺血3 h时显著低于对照组(P<0.01); 缺血2 h和4 h时差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表1 实验组不同处理时间大鼠炎性因子的变化情况

表2 对照组不同处理时间大鼠炎性因子的变化情况

表3 相同时间段预处理组和对照组NO水平的比较

与对照组比较, **P<0.01。

表4 相同时间段预处理组和对照组ET-1水平比较

与对照组比较, **P<0.01。

3 讨 论

及时恢复充足的血液供应是肢体缺血组织成活的关键，但是缺血组织再灌注又可导致缺血组织的进一步损伤，这即是缺血再灌注损伤(IR损伤)。大量研究[6]表明，氧自由基产生的增加及其诱发的脂质过氧化反应是引起骨骼肌缺血再灌注损伤的重要原因。研究表明，机体多种细胞在多种应激因素作用下既可以上调对诱导型NOS的表达，使NO产生增多，又可以上调对诱导型HO的表达，并产生大量NO, NO是中药气体信使分子，又是很强的自由基。研究[7]表明它既具有抑制炎性和氧化应激性损伤的作用，又具有介导此类损伤的作用。目前，对NO在骨骼肌缺血再灌注中的作用仍有争论。有研究认为作为一种自由基, NO具有氧化还原特性, NO可加重骨骼肌缺血再灌注损伤；也有研究[8]显示，左旋精氨酸源性NO可减轻骨骼肌、肾、肝、心、脑缺血再灌注损伤。孙永新等[9]研究缺血预处理(IPC)对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用及一氧化氮(NO)是否参与此保护作用，采用Wistar雌性大鼠，在左后肢跟部止血，同时使用血流监测仪测股四头肌的血流量，调整止血带的松紧程度，使血流量控制在上止血带前的30%，缺血再灌注组出现明显肌纤维破裂溶解，许多白细胞浸润，电镜下线粒体中含有大量空泡变性、肌纤维断裂、溶解和“Z线”排列整齐膜脂质过氧化物的增加。与缺血再灌注组相比，缺血预处理组显示了轻微的损害，正常的纤维和血管变形少，股四头肌各型肌纤维横截面积降低，细胞膜Ca2+-ATPase数量增加。实验认为缺血预处理对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤有明显保护作用，NO参与这一保护作用。

内皮内素(ET)作为调节心血管功能的重要因子，在局部通过特异性受体参与调节机体的许多生理活动及炎症反应，对维持基础血管张力与心血管系统稳态有重要作用。其中内皮素-1(ET-1)是迄今为止发现的作用最强的缩血管物质[10], 其引起的血管收缩、代谢紊乱和细胞增殖是与血管损伤有关疾病的共同致病因素。临床及实验研究发现ET-1可能参与心肌缺血再灌注损伤，心肌缺血再灌注时，可引起心肌细胞膜上ET-1结合点密度增加。ET-1促进心脏缺血再灌注损伤的机制与心肌膜上 ET-1 受体上调、促进胞内钙超载、PMN 聚集、黏附、氧自由基释放及内皮细胞自稳态失衡有关。高洪波等[11]观察肢体缺血预适应对大鼠肢体缺血再灌注后血浆和肺组织NO/ET-1比值的影响，结果显示LIR组血浆及肺组织的NO/ET-1比值明显减小；与LIP组比较，IPC组血浆及肺组织的NO/ET-1比值明显增大。说明缺血预适应可以调节肢体缺血再灌注后NO/ET-1比值失平衡而使组织损伤减轻。梁瑛琦等[12]实验观察一氧化氮(NO)、内皮素(ET)、谷丙转氨酶(ALT)在家兔肝缺血/再灌注损伤过程中的变化，认为缺血/再灌注导致血管内皮功能紊乱，即NO水平下降和ET水平升高，其在肝缺血/再灌注发生发展中起介导作用。

缺血预处理可以使肢体再缺血前经历短暂预适应过程能明显减轻长时间缺血后的再灌注损伤，这种保护作用不仅局限于肢体，对远程内脏器官再灌注损伤亦有很大作用[13]。本研究显示，经过缺血预处理后，大鼠血液中ET-1和NO均显著降低，基本随着缺血时间的时间增加而增加，在第1、3、7天的含量差异具有统计学意义；而14 d时，差异较小。实验认为，通过缺血预处理的方式可调节血液中的ET-1及NO含量，进而减轻缺血再灌注损伤，但预处理的最佳间隔时间和处理适应次数尚有待于进一步研究。

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Protective effect of ischemic preconditioning on reperfusion injury of limbs and changes of nitric oxide and endothelin 1

YAN Bin, Hasilu, Maihemuti·Yakufu, HOU Yanjie, XU Chao, Yilihamu·Tuoheti

(SecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang, 830063)

Objective To analyze the interventional effect of non-invasive limb ischemic preconditioning (IPC) on ischemia reperfusion injury and the changes of endothelin-1 and NO. Methods A total of 30 rats were randomly divided into control group and experimental group. The control group was not treated with ischemic preconditioning but with direct hemostasis at 2, 3 and 4 h. The experimental group was treated with ischemic preconditioning and hemostasis at 2, 3 and 4 h on the second day. ET-1, NO levels at 1, 3, 7, 14 days after restore the blood flow (reperfusion) were detected. Results NO in vivo in rats and ET-1 in the first 1, 3, 7, 14 days increased and then decreased. NO in the experimental group at 4 h after ischemia on the third day reached a maximum value, and NO in the control group 2 h after ischemia on 7thday reached a peak value. In the experimental group, ET-1 3 h after ischemic on the 7thday reached the maximum value, and in the control group ET-1 reached the maximum 4 h after ischemic on the third day (P<0.05). NO in the blood of rats in the experimental group 2 h and 3 h after ischemic on the first, third and seventh days were significantly lower than those in the control group (P<0.01). On 14thday, NO 2 h after ischemia was significantly lower than the control group (P<0.01). In the experimental group, ET-1 in the blood on 1st, 3rd, 7thdays in each ischemia time were significantly lower than those in the control group (P<0.01), and on the 14thday, ET-1 3 h after ischemic was significantly lower than the control group (P<0.01). Conclusion Ischemic preconditioning can change serum NO and ET-1 levels after ischemia-reperfusion injury.

ischemic preconditioning; reperfusion injury; limb; nitric oxide; endothelin-1

2016-10-10

新疆医科大学2013年科研创新基金项目(XJC201368)

伊力哈木·托合提

R 541

A

1672-2353(2016)24-032-04

10.7619/jcmp.201624009