何培新，李芳莉，胡晓龙，李学思，郑　燕

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450001；2.河南省宋河酒业股份有限公司，河南鹿邑477265）

浓香型白酒窖泥可培养好氧细菌群落结构分析

何培新1，李芳莉1，胡晓龙1，李学思2，郑燕1

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450001；2.河南省宋河酒业股份有限公司，河南鹿邑477265）

采用稀释涂布法分离了浓香型白酒窖池窖泥中的好氧细菌，并利用形态学特征结合16S rRNA基因序列分析技术对分离的细菌进行鉴定，探讨窖泥可培养好氧细菌的群落结构。结果表明，根据菌落和细胞形态特征，分离到了1株无芽孢短杆菌和18株芽孢杆菌，均为革兰氏阳性；采用16S rRNA基因序列分析，将19株细菌鉴定为9个种：米氏解硫胺素芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、菠茨坦短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、Paenibacilluslautus、耐寒短杆菌和P.cellulositrophicus；其中波茨坦短芽孢杆菌、米氏解硫胺素芽孢杆菌和P.lautus鲜有浓香型白酒窖泥中分布的报道。本研究揭示了浓香型白酒窖泥可培养好氧细菌的群落结构，为改善窖泥质量、提高白酒品质等提供了理论依据。

浓香型白酒； 窖泥； 好氧细菌； 16S rRNA基因

浓香型白酒以固态窖池发酵为特征，窖池中的窖泥为发酵微生物的生长繁殖提供了良好环境[1-2]。窖泥微生物群落对白酒的品质及特征香型的形成具有重要的影响。参与形成白酒香味成分的细菌主要有己酸菌、乳酸菌、甲烷菌和硫酸盐还原菌等，以芽孢杆菌为主[3-5]。由于研究技术手段的限制，采用传统的形态学和生理生化特征鉴定分离到的窖泥细菌，不仅费时费力，还难得到准确的结果[6-8]。随着分子生物学技术的发展，传统形态学特征结合16S rRNA基因序列分析技术显著促进了微生物的分类与鉴定[9]，并广泛应用于窖泥微生物的相关研究[1，10-11]。本研究以河南省宋河酒业10年窖龄窖池的窖泥为研究对象，采用传统的微生物分离培养技术分离其中的好氧细菌，并通过形态学特征结合16S rRNA基因序列分析技术，对分离到的菌株进行鉴定，初步分析浓香型白酒窖泥中可培养细菌的群落结构，对改善窖泥质量、提高白酒品质等具有一定的理论意义。

1　材料与方法

1.1窖泥样品采集

以5点取样法采集河南省宋河酒业股份有限公司10年窖龄的窖池窖泥样品，混匀后迅速密封，置于冰上运输至实验室，4℃保存备用。

1.2窖泥细菌分离培养与初步鉴定

称取10g窖泥样品，加入到装有90m L无菌水的锥形瓶中，25℃、120 r/m in振荡30m in，然后放到洁净工作台静置30m in。在超净工作台中，用无菌注射器将过滤除菌的制霉菌素加入到融化并冷却至50℃的牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂20g，蒸馏水1000m L，pH 7.4～7.6）中，摇匀后制作平板。窖泥样品10倍系列稀释到105倍，取各稀释度的样品悬浮液0.2m L涂布在牛肉膏蛋白胨含药平板上，每个稀释度涂3个样，37℃恒温倒置培养48 h。计数细菌菌落数在30～300个的稀释度平板，取平均数计算得细菌总数和各种细菌的含量。对各种不同特征的菌落进行划线纯化，得到多个细菌菌株。采用普通光学显微镜观察各菌株的菌体形态，并进行革兰氏染色试验[12-14]。

1.3细菌基因组DNA提取

采用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒（上海生工）提取细菌的基因组DNA。

1.416S rRNA基因扩增

利用16S rRNA基因通用引物515F-GTGCCAGCMGCCGCGG和907R-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT进行PCR扩增[15]。PCR扩增体系如下：1μL引物515F（10μM），1μL引物907R（10μM），0.15μL taq酶（5 U/μL），2.5μL 10×buffer，4μL dNTP(各2.5mM)，1μLDNA模板，加无菌水补足至25μL。PCR扩增反应条件如下：94℃预变性5.0 min；94℃变性45 s，55℃复性45 s，72℃延伸1.0m in，30个循环；最后72℃充分延伸10m in。利用1%琼脂糖电泳检测扩增产物。

1.5克隆、测序及序列分析

利用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（上海生工）回收目的片段（约450 bp），利用pGEM-T载体试剂盒（北京全式金）克隆目的片段，利用M 13F/M 13R引物筛选出含有目的片段的克隆，送公司测序（上海生工）。

将测得的序列在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，选择相关同源序列与分离菌株序列利用Mega 6.0软件进行系统发育分析[15]。

2　结果与分析

2.1菌株分离与初步鉴定

结果表明，窖泥中的细菌总数为3.2×104cfu/g窖泥。根据菌落形态，共分离到19株代表性菌株（编号O2.1—O2.19）。各分离菌株的含量见表1。镜检观察发现，除O2.18为无芽孢的短杆菌以外，其他18株细菌均为产芽孢杆状细菌；革兰氏染色结果均为阳性。

2.2分离细菌的16S rRNA基因扩增

细菌基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测可见明显的DNA条带，无明显拖带现象，完整性较好（图1）。

图1　分离细菌DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱

利用16S rRNA基因通用引物515F/907R进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测表明扩增产物长度约450 bp，与预期片段长度一致（图2）；阴性对照泳道无电泳条带（图2b），表明扩增体系未受污染。电泳结果显示，PCR扩增产物可以用于后续克隆、测序等分子生物学操作。

图2　PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析

2.3系统发育分析

在BLAST比对分析的基础上，对19株窖泥细菌的16S rRNA基因序列进行系统发育分析。结果表明，除O2.18以外，窖泥中分离出来的其他细菌都是芽孢杆菌，与形态学鉴定结果一致。在属分类水平上，O2.4、O2.10、O2.15属于芽孢杆菌属（Bacillus）；O2.9和O2.11属于短芽孢杆菌属（Brevibacillus）；O2.17和O2.19属于类芽孢杆菌属（Paenibacillus）；O2.1属于解硫胺素芽孢杆菌属（Aneurinibacillus）；O2.18属于短杆菌属（Brevibacterium）（图3）。在种水平上，O2.1为米氏解硫胺素芽孢杆菌（A. migulanus），O2.4为枯草芽孢杆菌（Ba.subtilis），O2.9为菠茨坦短芽孢杆菌（Br.borstelensis），O2.10为地衣芽孢杆菌（Ba.licheniformis），O2.11为侧孢短芽孢杆菌（Br. laterosporus），O2.15为短小芽孢杆菌（Ba.pumilus），O2.17为P.lautus，O2.18为耐寒短杆菌（Brevibacteriumfrigoritolerans），O2.19为P.cellulositrophicus（图3）。分离菌株与基因库相关菌株的16S rRNA基因序列的相似度均超过99%（表1）。

19株分离细菌的含量见表1。从表1可以看出，除O2.18不产芽孢（属于短杆菌属）以外，其他分离菌株均为产芽孢的杆状细菌，其中以米氏解硫胺素芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的含量相对较高，分别占可培养细菌总数的26.3%和21.2%。

3　讨论

本研究表明，采用16S rRNA基因序列分析的方法鉴定浓香型白酒窖泥中的细菌种类，与形态学鉴定结果一致，能够快速地把分离到的细菌鉴定到属或种的水平，实用性较强。该技术应用于浓香型白酒窖泥微生物鉴定的研究报道较多。赵辉等[1]采用微生物生理生化特征结合16S rRNA基因序列分析鉴定了浓香型白酒窖泥中高产己酸兼性厌氧细菌；叶光斌等[18]通过细菌和古菌的16S rRNA基因的系统发育分析，确定了浓香型白酒成熟窖泥中细菌和古菌的群落组成；郑琦等[4]采用16S rRNA基因序列分析鉴定了泸州老窖300年窖池窖泥中的微生物群系，将23株产芽孢细菌鉴定为3种芽孢杆菌属的种类。

表1　分离细菌的BLAST比对同源性及在窖泥中的含量

图3　窖泥分离细菌的16S rRNA基因序列系统发育分析

本研究分离到的浓香型白酒窖泥中的好氧细菌大多为产芽孢的细菌，其中米氏解硫胺素芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的含量较高，分别占可培养细菌总数量26.3%和21.2%，与游剑等[19]的研究结果一致；而分离到的波茨坦短芽孢杆菌、米氏解硫胺素芽孢杆菌和P.lautus等在以往的报到中鲜有出现。芽孢细菌成为浓香型白酒窖泥中的优势微生物群系，可能与窖泥的高酒精度和低含氧量有关。相对于其他非芽孢细菌，产芽孢的细菌能在这种相对恶劣的环境条件下大量生长繁殖，从而逐渐占优势地位[2，11，20-22]。此外，在浓香型白酒生产过程中，芽孢细菌能水解淀粉、蛋白质等大分子物质，并利用糟醅浸润到窖泥中的营养物质产生丁酸和己酸等有机酸，是重要的产酸和产香菌[2，20]。吴文睿等[23]以古井贡酒（浓香型白酒）的窖泥样品为研究对象，研究不同芽孢杆菌对白酒风味成分的影响。结果表明，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌的发酵液中含有大量3-羟基-2-丁酮和2, 3-丁二醇；3-羟基-2-丁酮具有特有的奶油香味，是酒液中的一种重要芳香成分，可用于合成2,3,5,6-四甲基吡嗪，赋予酒浓厚的风味；2,3-丁二醇是白酒中重要的多元醇之一，是主要甜味芳香物质，能使酒醇厚绵甜，有自然感；短小芽孢杆菌产己酸乙酯量、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的量较大，其在浓香型白酒的风味和口感方面起着重要作用。这些研究结果表明，芽孢杆菌的含量通常作为浓香型白酒窖泥质量评价的重要指标之一，其功能特性影响白酒品质，特别是对白酒生香更为重要，在白酒发酵中发挥着重要作用。

浓香型白酒是我国市场上主要的白酒类型，销量占中国白酒市场份额的70%左右。窖池作为浓香型白酒的发酵容器，其中的窖泥在浓香型白酒生产中扮演了比较重要的角色。本研究以浓香型白酒生产厂家宋河酒业的10年窖龄窖池的窖泥为研究对象，采用传统的稀释涂布法分离窖泥中的好氧细菌，并采用形态特征结合16S rRNA基因序列分析技术对菌株进行鉴定。研究结果表明，分离得到的19株细菌主要为产芽孢的细菌，分别属于9个不同的种，其中分离到的波茨坦短芽孢杆菌、米氏解硫胺素芽孢杆菌和P.lautus等在以往的报到中鲜有出现。本研究为揭示窖泥中可培养好氧细菌的群落结构，充分发挥有益微生物正常代谢活动，强化白酒中主体风味物质，提高酒类品质等提供科学依据。

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Analysisof the Community Structureof Aerobic Bacteria in PitM ud of Nongxiang Baijiu

HEPeixin1,LIFangli1,HU Xiaolong1,LIXuesi2and ZHENGYan1
(1.Schoolof Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou,He'nan 450001; 2.Songhe Distillery Co.Ltd.,Luyi,He'nan 477265,China)

s:In the experiment,aerobic bacteria in pitmud of Nongxiang Baijiu were isolated by dilution platingmethod,and then identified by morphological characteristics coupled w ith sequence analysis of 16S rRNAgene.The results indicated that,one strain of non spore-producing short rod-shaped bacterium and 18 strains of spore producinggram-positive bacteriawere isolated,and those 19 strainswere identified as 9 species by 16S rRNAgene sequencing analysis,including Aneurinibacillusmigulanus,Bacillus subtilis,Brevibacillus borstelensis,Ba.licheniformis,Br.laterosporus,Ba.pumilus,Paenibacillus lautus,Brevibacterium frigoritolerans and P.cellulositrophicus.Among them,the distribution of Br.Borstelensis,A.migulanus and P.Lautus in pitmud of Nongxiang Baijiu were seldom reported.This study revealed the community structure of aerobic bacteria in pitmud of Nongxiang Baijiu,and provided theoreticalevidence for improving pitmud quality and improving liquorquality.

Nongxiang Baijiu;pitmud;aerobic bacteria;16S rRNAgene

TS262.3；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2016）11-0065-04

10.13746/j.njkj.2016262

2016-08-29

何培新（1970-），博士，教授，主要从事发酵工程研究。

郑燕（1986-），博士，主要从事酿造酒工程研究。

优先数字出版时间：2016-10-12；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161012.1519.019.htm l。