侯建光，郭富祥，樊建辉，韩素娜，张俊峰，陈蒙恩

（河南仰韶酒业有限公司博士后研发基地，河南渑池472400）

陶香型窖池中1株高产乙酸乙酯酵母的筛选与鉴定

侯建光，郭富祥，樊建辉，韩素娜，张俊峰，陈蒙恩

（河南仰韶酒业有限公司博士后研发基地，河南渑池472400）

从仰韶陶香型窖池糟醅中筛选产香功能微生物，研究其与大曲酒香味物质之间的联系，并对产香功能菌进行分子生物学鉴定。采用传统微生物分离方法，从不同发酵阶段的陶香型窖池糟醅中分离获得25株酵母菌。以豆芽汁培养基为底物，对各酵母菌株进行单菌产香实验，经闻香评定，菌株YS/Y/22能够产生浓郁的酒香味和水果香味。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对该菌株的发酵产物进行挥发性成分检测分析，发现菌株YS/Y/22发酵产物的主要香味成分为乙酸乙酯，是大曲酒的重要香味成分之一，因此可确定菌种YS/Y/22为陶香型窖池糟醅中的1株产香功能菌。经形态学观察和分子生物学鉴定，确定菌株YS/Y/22为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）。

陶香型窖池； 产香微生物； 挥发性成分； 筛选； 鉴定

陶香型是豫酒的独有香型，属于今年来中国白酒行业的创新性香型，目前不少专家、学者对浓香、清香、酱香、芝麻香等香型的成因及发酵过程中产香微生物等进行了广泛深入的研究，但对陶香型白酒产香功能微生物的研究却未见报道。仰韶陶香型白酒是指在仰韶地域自然环境、生产原料、酿造工艺等因素的前提下，生产的兼有浓香型、清香型、酱香型、芝麻香型4种香型的白酒，其以幽雅的酱香和浓香的窖香为主体香韵，细腻的芝麻香和净柔的清香为载体，满足了广大消费者全方位饮酒舒适度的需求[1-3]。

本研究以仰韶地区不同发酵阶段的陶香型工艺窖池为研究对象，对其发酵各阶段糟醅中的产香微生物进行筛选，分析鉴定其挥发性代谢产物，探寻与陶香型白酒香味成分之间的关系，以期找到产香性能突出的菌株，改良窖池发酵功能菌群，为提高陶香型白酒的产质量和改善原酒风味奠定基础，为推动中国白酒地域资源的有效利用和地域资源型白酒企业健康发展提供支撑。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1酒糟样品

选取河南仰韶酒业有限公司陶香型窖池10口，从其酒糟入池后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、15 d、20 d、30 d的酒糟，采取五点取样法，将窖池酒糟分上、中、下3层进行取样，混匀，并分别用无菌袋保存至4℃冰箱备用。

1.1.2培养基

分离培养基：WL培养基；种子液培养基：葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，酵母浸出膏10g，蒸馏水1000 m L，pH5.0～5.5；发酵培养基：葡萄糖含量50g，豆芽汁200g，酵母粉5g，蒸馏水800m L。

1.1.3试剂

TaqDNA polymerase，dNTPs，DL2000TMDNAMarker，均购自西安热默尔生物科技；溶菌酶，蛋白酶K，酵母基因组DNA快速抽提试剂盒，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.4仪器与设备

SF-CT-1A型超净工作台：上海三发科学仪器有限公司；B203LED型生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司；KF960型PCR仪，杭州晶格科学仪器有限公司；50μm/30μm DVAB/CAR/PDMS固相微萃取头，美国Supelco公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；WD-9403C型紫外仪，北京六一生物科技有限公司；HYG-B型摇床，苏州培英实验设备有限公司；20m L带硅橡胶垫的样品瓶，美国Supelco公司；D-37520型离心机，德国SIGMA公司；Thermo Scientific Trace1310-ISQ气相色谱-质谱联用仪，美国赛默飞世尔而科技公司；DHP-9272电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；HH-型数显恒温水浴锅，常州普天仪器制造有限公司；LDZM-80KCS-Ⅱ型立式压力灭菌器，上海申安医疗器械厂。

1.2实验方法

1.2.1酵母菌的分离与纯化

采用稀释平板涂布法对微生物进行分离培养。准确称取1g酒糟样品，置于装有99m L无菌水的三角瓶中，振荡30min。然后用移液枪吸取100μL振荡均匀的菌悬液，置于装有900μL无菌水的1.5m L离心管中，振荡均匀，以此10倍逐级稀释至10-7。取10-5、10-6、10-73个稀释度的菌悬液100μL于WL培养基上进行平板涂布，之后于28℃倒置培养48 h。待长出适宜大小菌落后，选取具有典型酵母菌特征的菌落进行分离纯化、镜检编号，接种于斜面试管中保藏。

1.2.2产香实验

分离的各酵母菌株分别接入对应编号的种子培养基中，于28℃培养48 h后，调节种子液浓度至107个/m L。之后按10%接种量接种于灭菌处理后的豆芽汁液体培养基中，以2℃培养7 d，然后对发酵产物进行闻香评定、挥发性成分鉴定。

1.2.3挥发性成分检测[4-5]

顶空固相微萃取条件：取8m L（10%）发酵液倒入20m L顶空瓶（专用）中，5μL内标（乙酸正戊酯和2-乙基丁酸），旋紧瓶盖，60℃孵化萃取45m in后取出萃取头，插入GC进样口热解吸5m in，热解吸温度250℃。

气相色谱条件：毛细管色谱柱为DB-FFAP（60m× 0.25μm，0.25μm），进样口和检测口温度均为250℃，载气为He，流速为2m L/m in。程序升温：初始温度为50℃，稳定2m in后，以4℃/m in升至230℃，保持15m in。

质谱条件：EI电离源，扫描范围20～550 u，电子能量70 eV，离子源温度230℃，接口温度230℃。

1.2.4产香功能菌株鉴定[6-7]

对筛选出的产香性能突出的菌株采用显微镜进行形态观察，并进行分子生物学鉴定。采用18S rDNA分子生物学对产香性能突出的酵母菌株进行鉴定，引物设计为NL-1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG和NL-4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG。利用PCR扩增技术对18S rDNA进行扩增后送样测序，将测序结果在国际GeneBank中进行BLAST比对，利用MEGA5.05软件进行多重序列同源性比对分析，并采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建系统发育树。

2　结果与分析

2.1微生物筛选、纯化结果

采用稀释平板涂布法对不同发酵阶段陶香型酒糟样品中的酵母进行分离，选取具有典型酵母菌特征的菌落进行纯化，结合显微镜下的细胞形态，得到酵母25株，分别编号为YS/Y/1—YS/Y/25。

2.2液体发酵产香结果

2.2.1液态发酵产物感官评价结果

将分离获得25株酵母的种子液接种至豆芽汁液体培养基中培养，然后对各菌株发酵产物进行外观、气味评价，其中6株酵母发酵后香气较好，其发酵7 d后的液态产物感官评价结果见表1。

表1　各菌株液态发酵产物感官评价

由表1可知，各菌株发酵豆芽汁液体培养基后所产生的感官特征各异。酵母菌株YS/Y/7、YS/Y/8、YS/Y/ 11、YS/Y/20、YS/Y/22、YS/Y/25发酵后产物有令人愉悦的香味，可初步确定为具有产香性能的菌株。其中菌株YS/Y/22经过28℃发酵7 d后，发酵基质呈深黄色，菌体生长旺盛，发酵液内有白色呈现，且带有浓郁的酒香味和水果香味。其他菌株发酵后均未产生令人愉悦的香味，或保持豆芽汁培养基原味，或无味或产生怪味。综合来看，菌株YS/Y/22的产香性能较为突出，可作为下一步挥发性发酵产物研究的菌株。

图1　菌株YS/Y/22发酵产物挥发性物质GC-MS总离子流色谱图

2.2.2液态发酵产物挥发性成分测定结果

对菌株YS/Y/22发酵7 d后的液态产物采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术测定其中的挥发性物质，其萃取的挥发性物质的总离子流色谱图见图1，分析鉴定出的挥发性物质见表2。

表2　菌株YS/Y/22发酵产物挥发性物质测定

对菌株YS/Y/22的发酵产物跟踪进行感官和挥发性成分分析，结果表明，随着发酵时间的延长，发酵基质由原来的豆芽汁原味、无香味，演变为浓郁的酒香味和水果香味。刚开始发酵原料中并无乙酸乙酯的存在，到发酵7 d时色谱峰达到峰值。其他物质在发酵过程中含量波动变化、不稳定，发酵过程中这些物质有可能存在生成及转化两方面的作用，还有待进一步研究。酵母YS/Y/22发酵产生乙酸乙酯的能力较强，而乙酸乙酯属于大曲酒的主要酯类香味成分，因此，可确定酵母菌株YS/Y/22为陶香型白酒的产香功能菌。

2.3产香菌株鉴定结果（图2、图3、图4）

经对YS/Y/22菌体进行DNA提取、目的片段PCR扩增后[8]，将PCR产物送往上海杰里公司测序，测序结果在GeneBank数据库中进行比对，结果表明，菌株YS/Y/22与 Wickerhamomyces anomalus FJ972217.1相似性为99%。利用Mega5.05软件通过N-J法对菌株YS/Y/22构建系统发育树，结果见图2。菌株YS/Y/22的菌落及菌体形态见图3、图4。根据菌株rDNA的相似性、系统发育树和菌体形态，初步鉴定菌株YS/Y/22为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）。

图2　基于18S rDNA序列同源性构建的菌株YS/Y/22系统发育树

图3　酵母YS/Y/22菌落形态图

图4　酵母YS/Y/22菌体形态图

3　结论

本研究采用了单菌发酵实验研究从陶香型窖池糟醅中筛选出的酵母微生物，共筛选出6株产香酵母，其中菌株YS/Y/22产香能力最强，其挥发性香味成分主要是具有酒香味和水果香味的乙酸乙酯，属于陶香型白酒的香味成分之一。经分子生物学鉴定，菌株YS/Y/22为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。对于酵母YS/Y/22的产香机理和影响因素以及多菌共同发酵的效果、相互作用等将在后续研究中陆续进行，以期早日运用于生产实践，改善原酒口感提高技术参考。

[1]樊建辉,侯建光,郭富祥,等.仰韶超高温大曲发酵过程中微生物变化的初步分析[J].酿酒,2015,42(1)：49-51.

[2]侯建光,郭富祥,樊建辉,等.寒暑季节仰韶陶香型大曲指标差异性研究[J].酿酒,2016,43(1)：23-25.

[3]侯建光,郭富祥,樊建辉,等.夏季仰韶陶香型中高温大曲曲表和曲心指标动态演变的研究[J].酿酒科技,2016(3)：88-89.

[4]侯建光,韩素娜,樊建辉,等.应用HS-SPME和GC-MS浅析陶香型白酒中挥发性成分[J].酿酒,2016(3)：37-40.

[5]Zhang R,Wu Q,Xu Y.Aroma characteristicsofMoutai flavor liquor producedw ith Bacillus licheniformis by solid state fermentation[J].Letters in Applied M icrobiology,2013,57(1)：11-18.

[6]罗惠波,杨晓东,杨跃寰,等.浓香型大曲中可培养真菌的分离鉴定与系统发育学分析[J].现代食品科技,2013,29(9)：2047-2052.

[7]明红梅,郭志,周健,等.浓香型大曲中产香微生物的筛选及鉴定[J].现代食品科技,2015,31(4)：186-191.

[8]Yeg B,Wang SF,Jiang L J,etal.Distribution and diversity of Bacteria and Archaea inmarine sedimentsaffected bygas hydratesatM ississippiCanyon in theGulfofMexico[J].geom icrobiology Journal,2009,26(6)：370-381.

Screening and Identification of a Strain w ith High Yield of Ethyl Acetate from Taoxiang Pits

HOU Jianguang,GUO Fuxiang,FAN Jianhui,HAN Su'na,ZHANG Junfeng and CHENMengen
(Yangshao Distillery Co.Ltd.,M ianchi,He'nan 472400,China)

In the experiments,25 yeaststrainswere isolated from fermentedgrains in Taoxiang pits in different fermenting stagesby traditional m icrobe isolationmethods.Then bean sproutsmedium was used as the substrate for aroma-producing experiment of each single yeast strain. Aroma assessment suggested that yeast strain YS/Y/22 could produce strong fruit aroma and w ine aroma.The volatile compounds of such strainwere analyzed by HPLC-GC-MSand itwas found that itsmain flavoring compound wasethylacetate,whichwasoneof themost important flavoring compounds in Daqu.Accrodingly,strain YS/Y/22 was an aroma-producing functionalm icrobial strain.Itwas identified as Wickerhamomycesanomalus throughmorphologicalobservation andmolecularbio-assay.(Trans.by YUEYang)

Taoxiang pits;aroma-producingm icrobes;volatile compounds;screening;identification

TS262.1；TS261.4；TS261.3；Q93-3

A

1001-9286（2016）11-0056-04

10.13746/j.njkj.2016227

2016-07-15

侯建光(1968-)，男，在职研究生，高级工程师，E-mail：610365356@qq.com。

樊建辉(1976-)男，大专，工程师，E-mail：fanjianhui2006@163.com。