王 蕾，刘思洋，孙宁阳，李佳川，顾 健

(西南民族大学药学院，四川 成都 610041)

藏药波棱瓜子有效成分波棱素对ConA诱导的免疫性肝损伤的保护作用

王 蕾，刘思洋，孙宁阳，李佳川，顾 健

(西南民族大学药学院，四川 成都 610041)

目的通过建立ConA诱导的免疫性肝损伤动物模型，研究波棱瓜子有效成分波棱素对免疫性肝损伤的保护作用.方法一次性动物尾静脉注射刀豆球蛋白(20mg/kg)建立小鼠免疫性肝损伤模型，考察不同剂量的波棱素对小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)，以及肝组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量(或活性)的影响.结果小鼠尾静脉注射ConA后，模型组小鼠血清AST、ALT等活性明显升高，说明ConA诱导的损伤模型造模成功.给予波棱素药物后，与模型组相比较，波棱素能明显降低小鼠ALT、AST和LDH活性，降低小鼠肝组织MDA的含量；升高肝组织SOD和GSH-Px的活性.结论波棱素能明显减轻ConA诱导的小鼠肝组织损伤，改善其炎症反应，保护肝脏组织.

波棱瓜子；波棱素；免疫性肝损伤

藏药波棱瓜子是葫芦科攀援草本植物波棱瓜(Herpetosperalga pedunculosum Wall.)的种子，主要用于对肝病肝炎的防护和辅助医治肝组织疾病[1].已有前期实验表明藏药波棱瓜子总木脂素是波棱瓜子的有效部位[6-8]，而波棱素是其重要的有效单体成分之一[9-13].本研究拟通过ConA诱导建立小鼠免疫性肝损伤模型，探讨波棱瓜子有效成分波棱素对免疫性肝损伤的保护作用.

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

波棱素:波棱瓜种子以80%乙醇回流，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯部位依次经过硅胶色谱梯度和等度洗脱进行分离，高效液相进行物质纯化得波棱素，经HPLC含量测定其纯度＞95%.刀豆蛋白A(ConA)购自Sigma公司；清开灵注射液(批号: 14223163)购自神威药业；ALT(批号:2015020)、AST (批号:2015009)购自长春汇力生物技术有限公司；LDH(批号:YZB/京0798-2010)自中生北控生物科技有限公司；MDA(批号:20151011)、SOD(批号: 20151010)和GSH-Px(批号:20151011)购自南京建成生物工程有限公司.

1.2 仪器

722 N型可见分光光度计，上海莱帕德科学仪器有限公司生产；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪，常州市中威医疗仪器有限公司生产.

1.3 动物

ICR雄性小鼠(体质量20±2g)，动物合格证号: 0014485，动物许可证号:SCXK[川]2013-24，购于成都达硕实验动物研究中心.

1.4 方法

ICR雄性小鼠，按体量分层随机分成5组，即空白组、模型组、清开灵注射液组(20mg/kg)和波棱素组(10、20mg/kg)，每组8只.每天按设计剂量给予相应药物，连续7d.于末次给药后1h，除空白组以外，其余各组动物经尾静脉注射ConA(20mg/kg)建立小鼠免疫性肝损伤模型.检测指标如下:

(1)肝脏系数

称取小鼠体质量，记录数据.待小鼠取血后立即脱颈处死，称取小鼠肝脏质量，计算肝脏系数.肝脏系数(%)＝(肝脏质量/小鼠体质量)×100%

(2)血清ALT、AST和LDH的测定

小鼠尾静脉注射ConA后(期间禁食不禁水10h)，眼眶取血，3000rpm/min离心10min，分离血清，冻存备用.按试剂盒说明书分别检测小鼠血清AST、ALT(赖氏法)以及LDH(速率法)的含量.

(3)肝组织MDA、SOD和GSH-Px的测定

待小鼠处死后，每只小鼠取肝脏同一部位组织制备10%肝脏匀浆.按试剂盒说明书分别检测小鼠肝组织MDA、SOD和GSH-Px的活性.

1.5 数据分析

2 实验结果

2.1 对肝脏系数的影响

由表1可知，与空白组比较，模型组小鼠的肝脏系数明显增大；与模型组比较，波棱素高、低剂量组和清开灵注射液组能明显降低小鼠的肝脏系数，减少肝脏水肿.

表1 波棱素对ConA致免疫性肝损伤小鼠肝脏系数的影响(，n＝8)Table 1 Effects of Herpetin on the liver coefficients of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

表1 波棱素对ConA致免疫性肝损伤小鼠肝脏系数的影响(，n＝8)Table 1 Effects of Herpetin on the liver coefficients of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

与模型组比较，∗p＜0.05，∗∗p＜0.01.

组别剂量/mg·kgˉ1动物数/只肝脏系数%空白-83.97±5.37∗∗模型-85.54±4.84清开灵注射液2084.35±5.62∗∗波棱素1084.57±5.37∗∗2084.36±5.38∗∗

2.2 对血清相关生化酶活性的影响

由表2可知，与空白组比较，模型组小鼠血清中LDH、AST和ALT的含量明显升高，表明小鼠肝功能受到损伤，造模成功；与模型组比较，波棱素高、低剂量组和清开灵注射液组均能明显降低肝损伤小鼠LDH、AST和ALT的含量，减少炎症的发生.

表2 波棱素对ConA致免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST和LDH活力的影响(，n＝8)Table 2 Effects of Herpetin on the levels of serum ALT，AST and LDH of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

表2 波棱素对ConA致免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST和LDH活力的影响(，n＝8)Table 2 Effects of Herpetin on the levels of serum ALT，AST and LDH of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

与模型组比较，∗p＜0.05，∗∗p＜0.01.

2.3 对肝组织中相关生化酶活性的影响

由表3可知，与空白组比较，模型组小鼠肝组织匀浆中MDA活性明显上升，SOD、GSH-Px活性明显减少；与模型组比较，波棱素高、低剂量组和清开灵注射液组均能明显降低小鼠肝组织中MDA的活性，升高SOD和GSH-Px的活性.提示波棱素具有一定的清除自由基，保护肝细胞膜，提高抗氧化的能力.

表3 波棱素对小鼠ConA致免疫性损伤肝匀浆中MDA、SOD和GSH-Px水平的影响(，n＝8)Table 3 Effects of Herpetin on the levels of MDA，SOD and GSH-Px levels in liver homogenate of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

表3 波棱素对小鼠ConA致免疫性损伤肝匀浆中MDA、SOD和GSH-Px水平的影响(，n＝8)Table 3 Effects of Herpetin on the levels of MDA，SOD and GSH-Px levels in liver homogenate of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

与模型组比较，∗p＜0.05，∗∗p＜0.01.

3 讨论

肝损伤是各种肝脏疾病发生发展的重要病理过程，肝损伤的发生机制一般分为化学性和免疫性两种方式.免疫性肝损伤主要为免疫变态反应，是抗原或半抗原刺激后机体产生的体液性或细胞性异常的一种免疫反应，能使组织损害或产生机能障碍[14].1992年Tiegs[2]等以ConA诱导的特异性肝损伤是目前运用较广的免疫性肝损伤模型之一.ConA是一种能诱导特异性肝损伤的T细胞丝裂原，给予ConA后，巨噬细胞和T淋巴细胞被激活，并分泌TNF-α和INF-γ等相关细胞因子损伤肝细胞或激活一系列损伤肝细胞的反应.ConA诱导的免疫性肝损伤与人类免疫性肝炎的发病原因与致病机理具有相似性[3-5].

大量实验表明，当肝组织受到损害时，胞浆中AST、ALT和LDH等相关酶将进入血液中，通过检测血清中相关酶的活性能反映肝功能的恢复情况.本实验通过连续7d给予波棱素后，波棱素能使肝损伤小鼠体内的LDH、AST和ALT的含量明显下降，减轻小鼠肝脏系数，显示出波棱素具有一定的保护肝组织作用；同时，MDA是组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的，它的含量与机体遭受自由基损害的程度有密切的关系；而SOD和GSH-Px的含量的高低则可以评定机体抗氧化水平.SOD在需氧生物体中几乎普遍存在，它能清除炎症中产生的自由基，显示出抗氧化作用.机体内广泛存的GSH-Px是重要的催化过氧化物分解的酶，它特异地催化谷胱甘肽对氢过氧化物的还原反应，抑制脂质过氧化，保护细胞膜的完整性[5-7].本实验研究表明，波棱素能能明显降低小鼠肝组织MDA的活性，升高SOD和GSH-Px的活性，显示出波棱素抗肝组织损伤可能与药物清除自由基，保护肝细胞膜，提高抗氧化能力和减少炎症等机制相关.综上所述，波棱素具有确切的降低ConA引起的肝损伤酶活力增加，有效改善肝组织炎症和病变，保护肝脏组织免受侵害.

[1]林小静，宋腾飞，耿岩玲，等.藏药波棱瓜子研究进展[J].现代农业科技，2012，23:82-84.

[2]TIEGS G，HENTSCHEL J，WENDEL A.A T cell-dependent experimental liver injury in mice inducible by concanavalin A.[J].Journal of Clinical Investigation，1992，90(1):196-203.

[3]胡水清，黄依雯，秦伟，等.Con A诱导小鼠肝损伤模型的发病机制[J].中国血液流变学杂志，2007，17(1):159-162.

[4]张修礼，曲建慧.小鼠ConA性肝损伤模型[J].世界华人消化杂志，2001，5:571-574.

[5]阮连国，张妍，朱清静，等.肝脾调补方对小鼠免疫性肝损伤的防护作用[J].中西医结合肝病杂志，2012，22(6):363-365.

[6]顾健，李佳川，樊利娜，等.藏药波棱瓜子总木脂素对刀豆球蛋白(ConA)致免疫性肝损伤小鼠保护作用及其机制探讨[J].西南民族大学学报(自然科学版)，2014，40(3):375-387.

[7]王翔朴，王营通，李珏声.卫生学大辞典[M].青岛:青岛出版社，2000:63.

[8]赵兴冉，章雷，李佳川，等.藏药波棱瓜子总木脂素对四氯化碳(CCl_4)致化学性肝损伤小鼠保护作用[J].西南民族大学学报(自然科学版)，2015，41(2):181-185.

[9]张梅.藏药波棱瓜子治疗肝病有效成分的研究[D].成都:成都中医药大学，2003.

[10]张鑫，谭睿，顾健，等.波棱素脂质体冻干粉针的制备及初步安全性和药效学研究[J].中国中药杂志，2014，39(16):3065-3068.

[11]GU J，YUAN Z，TAN R，et al.Isolation of herpetin from Herpetospermum seed and hepatoprotective activity of liposomal herpetin against carbon tetrachloride-induced liver injury in mice[J].Pharmazie，2015，70(11):745-752.

[12]YUAN H L，LIU Y，ZHAO Y L，et al.Herpetin，a New Bioactive Lignan Isolated from Herpetospermum caudigerum[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2005，14(3):140-143.

[13]周雪杉.藏药波棱瓜子木脂素类成分系统研究[D].成都:西南交通大学，2014.

[14]袁世全，冯涛.中国百科大辞典[M].北京:华厦出版社，1990: 944.

(责任编辑:李建忠，付强，张阳，罗敏；英文编辑:周序林，郑玉才)

Protection of Herpetin from Tibetan medicine Herpetospermum seeds on ConA-induced immunologic liver injury in mice

WANG Lei，LIU Si-yang，SUN Ning-yang，LI Jia-chuan，GU jian
(School of Pharmacy，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

Objective To study the protection effect of the bioactive Herpetin from Herpetospermum seeds on immunologic liver injury induced by ConA.Methods Mice were injected intravenously with ConA(20mg/kg)in order to establish the mice immunological liver injury model.Activities of ALT，AST，LDH in serum and MDA，SOD and GSH-Px levels in liver tissues were evaluated in different dose groups.Results After mice tail vein injection with ConA，the increased activities of ALT and AST in serum indicated that the mice immunological liver injury model induced by ConA was successful.Compared with the control group it was shown that Herpetin can significantly reduce the activities of hepatic ALT，AST and LDH，and also decrease the MDA content.Furthermore，elevated activities of SOD and GSH-Px were observed.Conclusion Herpetin can significantly decrease immunological liver injury induced by ConA，and reduce inflammatory response to protect liver tissues from damage.

Herpetospermum seeds；Herpetin；immunological liver injury

R285；R29

A

2095-4271(2016)05-0492-04

10.11920/xnmdzk.2016.05.004

2016-07-13

顾健(1967-)，男，汉族，教授，博士生生导师，研究方向:中药及民族药物基础研究与开发.E-mail:gujiancd＠163.com

国家自然科学基金项目(81274168、81573563)；四川省中医药管理局科研项目(2016C062)