许晓义 宋高臣 何志鹏 孙 健 代海兵 张 波 武蕾蕾

(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)



H22荷瘤小鼠组织蛋白质的双向电泳比较

许晓义 宋高臣 何志鹏 孙 健 代海兵 张 波1武蕾蕾

(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

目的 建立H22荷瘤小鼠组织蛋白质双向凝胶电泳图谱，初步分析肝癌小鼠组织蛋白质的差异表达。方法 分别取对照组小鼠正常肝组织和H22荷瘤小鼠瘤组织，利用双向电泳技术分离对照组正常肝组织及荷瘤组瘤组织的蛋白质，获得图谱后通过ImageMaster 5.0软件分析两组蛋白表达的差异特性。结果 组织分析结果表明，差异明显的蛋白点有22个，其中在荷瘤组有16个点高表达，6个低表达；有19个点仅在对照组出现，新增27个点在荷瘤组表达。结论 异常蛋白表达与细胞增殖异常、代谢紊乱、肿瘤发生密切相关。

双向电泳；组织；差异蛋白；肝癌

肿瘤的发生发展是一个多因素参与的过程并且复杂多变，双向电泳技术(2-DE)对蛋白质的分析具有整体性和广泛性，在恶性肿瘤的研究中得到广泛应用，利用2-DE可以分离正常组织细胞与肿瘤之间的差异蛋白质组分，为寻找肿瘤的生物标志物和肿瘤的发病机制以及开发新的肿瘤治疗方式和治疗药物提供大量的理论依据〔1〕。本研究利用2-DE技术比较对照组正常肝组织及荷瘤组瘤组织蛋白表达的差异特性。

1 材料与方法

1.1 动物与廇株 昆明种小鼠20只，18～22 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，小鼠转移性腹水型肝癌细胞株H22，由中国医学科学院肿瘤研究所引进。

1.2 主要试剂与仪器设备 AgNO3(和光纯业工业株式会社)，IPG Buffer(GE)，Tris(Sigma)，DTT(Sigma)，固相pH梯度干胶条(GE)，Ettan DALT twelve电泳系统(GE)，IPGphor3等电聚焦仪(GE)，ImageMaster 5.0分析软件(GE)等。

1.3 方法

1.3.1 H22荷瘤小鼠模型建立 无菌条件下抽取接种第6～7天生长良好的H22肝癌小鼠的腹水(活癌细胞数>97%)，用无菌生理盐水1∶3稀释，调整细胞浓度约2×107个/ml，0.2%台盼蓝染色，计活细胞数大于95%，无菌操作。小鼠右前肢腋部皮下接种0.2 ml/只制备实体瘤模型。设立对照组(正常小鼠)与荷瘤组，每组10只，同条件饲养。

1.3.2 组织收集及样品处理 将各组小鼠处死，分别取对照组肝组织、荷瘤组瘤组织各约0.4 cm×0.4 cm，无菌条件下生理盐水反复清洗，液氮保存。取冻存组织，各自称重30～90 mg，研磨匀浆后置于450 μl裂解液中混匀，37℃孵育1 h，10℃，40 000 r/min，离心15 min，吸取上清液。

1.3.3 双向凝胶电泳 取两组小鼠组织样品，按PI进行第一向固相pH梯度等电聚焦分离，再根据分子量进行第二向SDS-PAGE分离，获得两组蛋白质图谱。

1.4 图像扫描及分析 运用ImageMaster5.0软件对两组组织蛋白质图谱进行分析，找出差异表达蛋白质点。

2 结 果

对照组和荷瘤组组织的2-DE图谱见图1，图2。对照组与荷瘤组差异蛋白点分析见表1，表2。组织分析结果表明，差异明显的蛋白点有22个，其中在荷瘤组有16个点高表达，6个低表达；有19个点仅在对照组出现，新增27个点在荷瘤组表达。

图1 对照组和荷瘤组蛋白表达图谱

图2 对照组与荷瘤组的差异蛋白点

IDPIMW(D)表达情况差异程度(倍)6045095114601+2170348098668116324-1513482551606811395+15134113053160720636+14173725586643833369-1149635881560817534+11474629152124735894+9302515638953525167+5420610346094118013+540542270808710911+5271911171733618605+5187922951976731785+5102511966479919483+4734236669957742201+4549086778615215353-41587524259968333046-39854114344762222702+36750526079244233648-3568729081390117165+35603374798133625+3493272998168636548+34718819278652229119-344262

“+”表示在荷瘤组高表达；“-”表示在荷瘤组低表达

表2 对照组与荷瘤组特有的蛋白质点

3 讨 论

肝癌是临床上常见的一种恶性度极高、诊治困难、发生发展迅速、预后极差的肿瘤〔2〕。在非洲、东南亚和我国，肝癌发病率已位于肿瘤发病率的前五位，是全球癌症相关性死亡的主要原因之一。根据2001年我国卫生部恶性肿瘤死亡率统计资料显示，我国城市地区肝癌居死因顺位的第2位，在农村地区居死因顺位的首位〔3，4〕。

2-DE是按照蛋白质分子量与等电点的差别最终将各蛋白质进行分离的技术〔5，6〕。近年来，随着技术的不断进步，2-DE技术因具有高灵敏度、高分辨率、重复性好及高通量，可利于计算机对其进行图像处理分析，具有较好地与质谱等鉴定方法相匹配的优点，使其在蛋白质组学的研究中成为最常见的用于分离蛋白质的技术手段〔7～9〕。

机体内蛋白质间相互作用平衡的稳定性决定着机体正常功能的维持，如果失衡可导致细胞增殖异常、代谢紊乱等，从而引起肿瘤的发生。H22肝癌特有蛋白质组分的存在说明他们可能与肝癌的发生相关，而且其中部分蛋白质可能是肝癌的标志性蛋白，有可能作为肿瘤特异而敏感的标志物用于早期特异性诊断。本研究为进一步研究肝癌的发病机制、特异性标志物、早期诊断和选择合理治疗等相关研究奠定了一定的基础。

1 Gong Z，Sun P，Chu H，etal.Overexpression of sorcin in multidrug-resistant human breast cancer〔J〕.Oncol Lett，2014；8(6)：2393-8.

2 El-Serag HB，White DL，Nurgalieva Z.Epidemiology of hepatocellular carcinoma〔J〕.Surg Oncol Clin North Am，2015；24(1)：1-17.

3 Yue Z，Jian-Song R，Ju-Fang S，etal.International trends in primary liver cancer incidence from 1973 to 2007〔J〕.BMC Cancer，2015；15(1)：1-11.

4 Wu CY，Lin JT.The changing epidemiology of Asian digestive cancers：from etiologies and incidences to preventive strategies〔J〕.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2015；29(6)：843-53.

5 Gygi SP，Corthals GL，Zhang Y，etal.Evaluation of two-dimensional gel electrophoresis-based proteome analysis technology〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2000；97(17)：9390-5.

6 Pomastowski P，Buszewski B.Two-dimensional gel electrophoresis in the light of new developments〔J〕.Trend Analyt Chem，2014；53：167-77.

7 尹 稳，伏 旭，李 平.蛋白质组学的应用研究进展〔J〕.生物技术通报，2014；(1)：32-8.

8 Bhatnagar S，Katare DP，Jain SK.Serum-based protein biomarkers for detection of lung cancer〔J〕.Open Life Sci，2014；9(4)：341-58.

9 何渝军，牟芝蓉，黎万玲，等.利用2DE-MS技术筛选和鉴定大肠癌血清标志物〔J〕.第三军医大学学报，2012；34(18)：1835-8.

〔2016-06-13修回〕

(编辑 郭 菁)

黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目(1251G066)；牡丹江市科学技术计划项目(Z2014s031)

武蕾蕾(1981-)，女，实验师，主要从事中医药抗肿瘤分子生物学机制研究。

许晓义(1981-)，男，讲师，主要从事中医药抗肿瘤分子生物学机制研究。

R73

A

1005-9202(2016)22-5515-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.009

1 牡丹江市肿瘤医院