勾新磊，赵新颖，高 峡,2，周明强，刘伟丽,2

(1.北京市理化分析测试中心，有机材料检测技术与质量评价北京市重点实验室，北京 100089；2.北京市科学技术研究院分析测试技术重点实验室，北京 100089)



超高效液相色谱-串联质谱法测定保健食品中10种磷酸二酯酶-5抑制剂

勾新磊1，赵新颖1，高 峡1,2，周明强1，刘伟丽1,2

(1.北京市理化分析测试中心，有机材料检测技术与质量评价北京市重点实验室，北京 100089；2.北京市科学技术研究院分析测试技术重点实验室，北京 100089)

建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定保健食品中10种磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制剂。样品采用 Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)色谱柱分离，以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，甲醇为提取溶剂超声萃取，经HLB固相萃取柱净化浓缩；在电喷雾正离子模式下，以多反应监测(MRM)模式进行检测。结果表明，10种磷酸二酯酶-5抑制剂在1.0～100.0 μg/L范围内线性关系良好，线性相关系数(R2)均大于0.993，方法定量限为1.0 μg/kg；空白样品在100.0、200.0和1 000.0 μg/kg添加水平下的回收率为85.6%～94.3%。该方法简便、快速、检出限低，适用于保健食品中10种磷酸二酯酶-5抑制剂的同时检测。

超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)；磷酸二酯酶-5抑制剂(PDE-5)；固相萃取；保健食品

近年来，随着工作和生活压力的逐渐加大，很多人会出现易疲劳、免疫力下降等症状，因此，可以缓解这些症状的保健食品应运而生。然而，一些不法商贩受利益驱使，在壮阳、补肾、抗疲劳类保健食品中非法添加西地那非、伐地那非、他达拉非等磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制剂以增强其效果[1]。消费者误服或长期大量使用，会出现头晕、恶心等症状，严重者会造成肾功能、心脏功能及心血管系统的损伤[2-3]。因此，建立保健食品中磷酸二酯酶-5抑制剂的检测方法，对打击制假贩假行为、保护消费者健康具有重要意义。

目前，磷酸二酯酶-5抑制剂的检测方法主要有液相色谱法(LC)[4-7]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[8-14]。LC法灵敏度较低，无法满足违禁药物检测的要求；而LC-MS/MS法具有灵敏度高、检出限低、可同时进行多组分定性定量检测的特点，是目前报道较多的方法。但现有文献[13-14]均主要针对西地那非、伐地那非、他达拉非等常见的磷酸二酯酶-5抑制剂进行检测，而对通过化学修饰改变部分官能团得到的乌地那非、真地那非等磷酸二酯酶-5抑制剂的新型类似物关注较少，缺乏相关的检测方法研究。

本工作拟结合超声提取和固相萃取技术，采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法同时检测保健食品中10种磷酸二酯酶-5抑制剂，希望为相关保健食品的质量监督和安全保障提供技术支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Acquity 超高效液相色谱仪，XEVO TQ 串联质谱仪：美国Waters 公司产品，配有Masslynx4.1 工作站，Targetlyne数据分析软件；HLB 固相萃取柱(500 g/6 L)：美国 Waters 公司产品；KQ6000V超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司产品；N-EVAP-112氮吹仪：美国Organomation公司产品；Milli-Q 超纯水器：美国Millipore公司产品。

1.2 主要材料与试剂

豪莫西地那非、那莫西地那非、红地那非、伪伐地那非、硫代艾地那非标准品：纯度>95%，由中国食品药品检定研究院提供；西地那非、伐地那非标准品：纯度>95%，德国Dr. Ehrenstorfer 公司产品；他达那非、乌地那非、真地那非标准品：纯度>95%，加拿大TLC Pharma Chem公司产品；甲醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷、丙酮：均为色谱纯，美国Fisher公司产品；实验用水：由Milli-Q系统净化，经0.22 μm滤膜过滤的去离子水。

1.3 标准溶液的配制

分别准确称取适量的上述标准品，用甲醇溶解并定容，制得质量浓度均为1 000 mg/L的单标储备液。准确移取各标准储备液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1 mg/L的混合对照品储备液。所有标准溶液均在4 ℃下保存。

1.4 样品处理

称取1.0 g样品(片剂碾碎，胶囊去壳研细，液体直接称取)，置于25 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇，超声提取30 min，冷却至室温后，用甲醇定容，摇匀，静置5 min。取1.0 mL上清液，置于10 mL容量瓶中，用水定容，摇匀备用。

分别用5 mL甲醇、5 mL去离子水活化、平衡固相萃取小柱，加入1.0 mL上述样品溶液，用2 mL去离子水淋洗，弃去流出液。用4 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于氮吹管中，40 ℃氮吹至近干，再用甲醇定容至1.0 mL，过0.22 μm有机滤膜，待UPLC-MS/MS测定。如果样品含量过高，可根据具体情况进行稀释。

1.5 实验条件

1.5.1 色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流动相：A为0.1%甲酸-水溶液，B为甲醇溶液；流速：0.2 mL/min；柱温：35 ℃；梯度洗脱程序：0～7 min、40%～80%B，7～9 min、80%B，9～9.5 min、80%～40%B，9.5～11 min、40%B。

1.5.2 质谱条件 电喷雾电离正离子模式(ESI+)；多反应监测(MRM)模式；毛细管电压：3.0 kV；萃取电压：5.0 V；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流速：650 L/h；锥孔气流速：20 L/h。

2 结果与讨论

2.1 质谱和色谱条件的选择

采用蠕动泵以10 μL/min分别将10种磷酸二酯酶-5抑制剂的标准溶液单独注入质谱的离子源中，测定其在正离子(ESI+)和负离子(ESI-)模式下的质谱信号强度。结果表明，在ESI-模式下，部分磷酸二酯酶-5抑制剂未能检测到明显的[M-H]-准分子离子峰；而在ESI+模式下，10种磷酸二酯酶-5抑制剂均可获得较高丰度的[M+H]+准分子离子峰。确定母离子后，采用子离子扫描方式进行二级质谱分析，并对子离子进行优化选择，以确定定量离子和定性离子；然后对离子源温度、去溶剂气温度及流量、锥孔气流量等参数进行优化，使目标物的离子化效率达到最佳。10种磷酸二酯酶-5抑制剂的质谱参数列于表1。

表1 10种磷酸二酯酶-5抑制剂的质谱参数

注：*代表定量离子

实验分别考察了甲醇-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相的分离效果。结果表明，相对于乙腈体系，采用甲醇作为有机相可获得更好的分离效果和仪器响应；在流动相中加入0.1%甲酸，有助于化合物的离子化，可使目标物的响应增大，灵敏度增强。因此，选择甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相。另外，采用梯度淋洗可提高磷酸二酯酶-5抑制剂各组分在色谱柱中的分离效率。在以上优化的条件下，获得的10种磷酸二酯酶-5抑制剂的叠加总离子流图示于图1。

图1 10种磷酸二酯酶-5抑制剂的总离子流色谱图(50 μg/L)

2.2 提取条件的优化

实验分别考察了正己烷、二氯甲烷、丙酮、乙腈、甲醇作为提取溶剂时，各目标化合物的回收率，结果示于图2。可见，在1 000 μg/g加标水平下，使用正己烷作为提取溶剂时，各化合物的回收率最低；而使用甲醇作为提取溶剂时，10种磷酸二酯酶-5抑制剂的回收率最佳。因此，选择甲醇作为提取溶剂。

同时，进一步考察了提取时间对提取效率的影响。结果发现，在超声0～30 min时，10种磷酸二酯酶-5抑制剂的回收率均逐渐提高；而在超声30 min后，目标化合物的回收率没有明显提高。因此，确定超声时间为30 min。

2.3 固相萃取条件的优化

与传统的液液提取、液固提取相比，固相萃取技术可对目标物质进行选择性吸附，在完成样品富集的同时也使萃取液得到净化，且可明显提高灵敏度。

在1 000 μg/kg加标水平下，分别考察了ENVI-Carb柱、C18柱和HLB柱对各目标化合物回收率的影响，结果示于图3。可见，ENVI-Carb柱对10种磷酸二酯酶-5抑制剂的回收率均不足50%；C18柱和HLB柱所得的回收率比较接近，均高于80%，但HLB柱的回收率相对更高。这可能是因为HLB柱属于亲水亲酯的通用型固相萃取柱，与待测物有多个亲水性和亲酯性位点结合，过柱损失较少，因此回收率较高。

在1 000 μg/kg加标水平下，以甲醇为洗脱溶剂，比较了洗脱溶剂体积分别为2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL的洗脱效果。结果表明，随着洗脱溶剂体积的增加，10种磷酸二酯酶-5抑制剂的回收率明显提高；当洗脱溶剂体积大于4.0 mL时，各目标化合物的回收率趋于稳定。因此，最终选择4.0 mL甲醇溶液作为洗脱溶剂。

图2 不同提取溶剂对10种磷酸二酯酶-5抑制剂回收率的影响

图3 不同固相萃取柱对10种磷酸二酯酶-5抑制剂回收率的影响

2.4 基质效应与标准曲线

基质效应(matrix effects, ME)会对色谱系统的共洗脱化合物的电离程度产生影响：ME=1不产生基质效应，待测物电离不受干扰；ME>1为基质增强效应，待测物电离程度被增强；ME<1为基质抑制效应，待测物电离程度被减弱。本实验采用式(1)对基质效应进行评估。

ME=Ais/Ai

(1)

式中，Ais为净化后甲醇溶剂中添加待测物的系列标准溶液曲线的斜率；Ai为甲醇溶剂系列标准溶液曲线的斜率。

在1.0～100.0 μg/L浓度范围内，对10种磷酸二酯酶-5抑制剂系列混合标准工作溶液进行测定。结果表明，10种目标物质的基质效应均小于95.0%，存在基质抑制作用。为降低基质效应的影响，以空白样品经前处理后得到的甲醇溶液为空白溶剂，配制系列标准溶液，采用外标法进行定量测定。

分别以10倍信噪比(S/N=10)和3倍信噪比(S/N=3)计算10种磷酸二酯酶-5抑制剂的方法定量限(LOQ)和检出限(LOD)，结果列于表2。可见，10种磷酸二酯酶-5抑制剂在1.00～100 μg/L范围内的线性关系良好，线性相关系数(R2)均大于0.993；方法的定量限(LOQ)为1.0 μg/kg，检出限(LOD)为0.3 μg/kg。

表2 10种磷酸二酯酶-5抑制剂的线性方程、相关系数、检出限、定量限和基质效应

2.5 加标回收率和精密度

向空白片剂样品中分别添加不同浓度的标准溶液，进行加标回收率和精密度实验。添加水平分别为100.0、200.0、1 000.0 μg/kg时，所得上机测试液理论浓度水平为4.0、8.0和80.0 μg/L，每个添加浓度平行测定3次，结果列于表3。可见，各待测物的平均回收率为85.6%～94.3%。

2.6 实际样品分析

应用该方法对市售的20种具有抗疲劳、壮阳、补肾功能的保健食品(包括6种片剂、13种胶囊和1种保健酒)进行检测，结果列于表4。可见，除片剂4、5外，其余样品中均检出西地那非，含量为1.3～210.8 mg/g；在片剂1中同时检出伐地那非，含量为2.4 mg/g；在胶囊2中同时检出他达那非，含量为1.2 mg/g。

表3 加标回收率和精密度检测结果

表4 20种保健食品中磷酸二酯酶-5抑制剂的检测结果

3 结论

本工作建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定保健食品中10种磷酸二酯酶-5抑制剂。样品采用甲醇超声萃取，HLB固相萃取柱净化浓缩处理，UPLC-MS/MS检测。结果表明，10种磷酸二酯酶-5抑制剂在1.0～100.0 μg/L范围内线性关系良好，线性相关系数(R2)均大于0.993，方法定量限为1.0 μg/kg，检出限为0.3 μg/kg；空白样品在100.0、200.0和1 000.0 μg/kg添加水平下的回收率为85.6%～94.3%。应用该方法对市售的20种具有抗疲劳、壮阳、补肾功能的保健食品(6种片剂、13种胶囊和1种保健酒)进行检测，除2种片剂外，其余样品中均检出西地那非，含量为1.3～210.8 mg/g；在其中1种片剂中同时检出伐地那非，含量为2.4 mg/g；在1种胶囊中同时检出他达那非，含量为1.2 mg/g。该方法操作简单、检出限低、准确度高，能够满足保健食品中10种磷酸二酯酶-5抑制剂的实际检测要求，可为相关保健食品的质量监督和安全保障提供技术支持。

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Simultaneous Determination of Ten Phosphodiesterase-5 Inhibitors in Health Foods by Ultra Performance Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry

GOU Xin-lei1, ZHAO Xin-ying1, GAO Xia1,2, ZHOU Ming-qiang1, LIU Wei-li1,2

(1.BeijingKeyLaboratoryofOrganicMaterialsTestingTechnology&QualityEvaluation,BeijingCentreforPhysicalandChemicalAnalysis,Beijing100089,China;2.KeyLaboratoryofAnalysisandTestingTechnology,BeijingAcademyofScienceandTechnology,Beijing100089,China)

A method was developed for simultaneous determination of ten phosphodiesterase-5 (PDE-5) inhibitors in health foods by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS), such as vardenafil, acetildenafil, sildenafil, homosildenafil, udenafil, tadalafil, thioaildenafil, gendenafil, pseudovarnafil, norneosildenafil. The separation was performed using water containing 0.1% formic acid and methanol as mobile phases with gradient elution at a flow rate of 0.2 mL/min. Qualitative and quantitative analysis were achieved after the chromatographic separation on a Waters Acquity UPLC BEH C18 column (100 mm×2.1 mm×1.7 μm). The electrospray ionization (ESI) source in positive ion mode was used for analysis of ten phosphodiesterase-5 inhibitors in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. The nuclear ratio of parent ion and daughter ion, cone voltage, collision voltage were investigated. The sample was ultrasonic-assisted treatment using the methanol as extraction solvent, and then purified by Waters Oasis HLB solid-phase extraction (SPE) column. The results indicate that the linear range of the method is from 1.0 μg/L to 100.0 μg/L withR2>0.993, which means the method has a good linearity. The limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) of ten phosphodiesterase-5 inhibitors are 0.3-1.0 μg/kg and 1.0-2.5 μg/kg, respectively. The average recoveries of ten phosphodiesterase-5 inhibitors at three spiked levels of 100.0, 200.0 and 1 000.0 μg/kg are 85.6%-94.3%. The method was applied to analysis of the investigated compounds in twenty health foods. The results indicate that sildenafil are found in eighteen samples with the range of 1.3-210.8 mg/g, vardenafil and tadalafil are found in a tablet and a capsule, respectively. This method is accurate, simple, rapid and feasible for simultaneous determination of phosphodiesterase-5 inhibitors in health foods.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); phosphodiesterase-5 inhibitors (PDE-5); solid phase extraction; health foods

2015-12-02;

2016-01-27

北京市科学技术研究院创新工程Ⅲ-1项目(2015-178305)；北京市科学技术研究院萌芽计划项目(2015-02)资助

勾新磊(1983—)，男(汉族)，天津人，助理研究员，从事色谱质谱分析。E-mail: 817411@163.com

刘伟丽(1980—)，女(汉族)，山东人，副研究员，从事材料化学成分分析及检测。E-mail: liuweili@iccas.ac.cn

时间：2016-07-05；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160705.1207.008.html

O657.63

A

1004-2997(2016)06-0554-08

10.7538/zpxb.youxian.2016.0034