耿玉荣，陈欣欣，任宏强

(石河子大学医学院第一附属医院神经内科，新疆石河子 832002)



◇临床研究◇

细胞粘附分子-1基因K469E位点多态性与新疆哈萨克族不同类型脑梗死的相关性

耿玉荣，陈欣欣，任宏强

(石河子大学医学院第一附属医院神经内科，新疆石河子 832002)

目的 探讨细胞粘附分子-1(ICAM-1)基因K469E位点在新疆哈萨克族人群中的分布以及与不同类型脑梗死的相关性。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELP)，对新疆哈萨克族180例不同类型脑梗死患者(脑梗死组)及180例健康者(对照组)进行ICAM-1基因K469E位点多态性分析。结果 ICAM-1基因K469E位点K等位基因在脑梗死组及对照组间有统计学差异(χ2=8.455，P=0.004)，KK基因型在脑梗死组及对照组间有统计学差异(χ2=15.50，P=0.000)，大动脉粥样硬化(LAA)型脑梗死基因型频率KK 0.632、KE 0.250、EE 0.118，小动脉闭塞(SAO)型脑梗死基因型频率KK 0.683、KE 0.192、EE 0.125，两组相同基因型之间比较差异无统计学意义(χ2=0.864，P=0.649)，LAA组K等位基因频率0.757，E等位基因频率0.243，SAO组K等位基因频率0.779，E等位基因频率0.221，两组间比较无统计学差异(χ2=0.245，P=0.620)。结论 ICAM-1基因K469E位点多态性与新疆哈萨克族脑梗死相关，K等位基因可能是新疆哈萨克族脑梗死患者易感基因。

细胞粘附分子-1(ICAM-1)；K469E；基因多态性；脑梗死

在我国每年新发脑卒中患者约有250万，其中43%～79%是缺血性卒中。2006年开始在全国范围内进行的第3次死因抽样调查显示，脑卒中已成为我国城镇居民第1位的死亡原因。世界卫生组织的心血管病人群监测方案(MONICA)表明，我国脑卒中的发生率正以每年8.7%的速率上升，70%的存活者有偏瘫失语等残障，发病者约30%死亡[1]。更值得注意的是，在未来的20年里中国的脑卒中发生率将增加50%[2]。研究表明，脑卒中系遗传和环境因素相互作用的结果，可能与年龄、性别、生活方式及其他许多疾病有关。卒中发生危险因素的早期识别是降低脑卒中发生率的重要方式[3]。在对死亡的脑卒中患者进行脑解剖时发现内皮细胞ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)的表达显著增加，提示ICAM-1的表达与脑卒中的发生密切相关[4]。在缺血性脑卒中患者的血浆中可溶性ICAM-1水平也有明显升高[5]，这与ICAM-1基因多态性有关[6]。本课题组以往研究发现新疆哈萨克族脑卒中患者与ICAM-1基因G241R基因多态性无明确的相关性，本次研究进一步探讨ICAM-1基因K469E位点在新疆哈萨克族人群中的分布以及与不同类型脑卒中的相关性，为今后脑梗死防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 脑梗死组：符合第四次全国脑血管病会议修订的脑梗死诊断标准，经MRI或CT确诊[7]。纳入标准：根据急性卒中治疗低分子肝素试验病因分型法(Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment, TOAST)进行病因分型[8]，纳入：①大动脉粥样硬化型(large artery atherosclerosis, LAA)；②小动脉闭塞型(small artery occlusion, SAO)。LAA型脑梗死符合：通过血管检查发现颈动脉、大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉、椎基底动脉闭塞或狭窄程度≥50%，临床表现包括脑皮质损伤(失语症、忽视、失用症等)、脑干或小脑功能障碍。SAO型脑梗死符合以下3条中的其中1条即可：①临床有腔隙综合征表现，影像有与其相符的最大径小于1.5 cm的位于脑深部的梗死灶；②影像学无相应梗死灶，但临床表现为腔隙综合征之一；③临床不符合腔隙综合征，但头颅CT或MRI脑深部有最大径<1.5 cm的梗死灶。

排除标准：①TOAST分型中其他类型，心源性脑栓塞；其他原因所致的脑梗死；不明原因的脑梗死。②其他可能与ICAM-1基因相关的疾病:如冠心病心肌梗死、脑出血、系统性红斑狼疮、风湿性关节炎等。

对照组：为年龄、性别与病例组匹配的同期哈萨克族健康体检者180例，男性98例，女性82例，平均年龄(67.28±8.15)岁，彼此间无血缘关系，排除标准同脑梗死组。

本试验所有研究对象均签署知情同意书，通过医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 空腹后用含EDTA-Na2抗凝生化管抽取静脉血5 mL，-80 ℃储存。

1.2.2 基因组DNA的提取 使用北京百泰克基因组DNA提取试剂盒，严格按照说明书操作提取基因组DNA，产物保存在-4 ℃冰箱内。

1.2.3 基因扩增 采用聚合酶链反应(PCR)技术，对ICAM-1基因K469E目的片段进行扩增，使用引物设计软件premier5.0设计引物，K468E位点上游引物：5′-CTCCATGTCATCTCATCGTGT-3′，下游引物：5′-CATTATGACTGCGGCTGCTAC-3′(由上海生工生物工程公司合成提供)。扩增体系为15 μL，含10倍缓冲液1.5 μL、MgCl21.2 μL、dNTP 0.3 μL、引物各0.2 μL、模板DNA 0.5 μL、TaqDNA聚合酶0.1 μL。K469E位点反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，20个循环，72 ℃延伸6min，4 ℃保存。

1.2.4 基因型测定 取PCR产物10 μL，对ICAM-1基因K469E位点PCR产物加入限制性内切酶Bsh12361 2.0 μL，37 ℃水浴过夜，对酶切产物使用40 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，运用凝胶成像系统观察电泳结果并保存。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0 统计软件进行统计分析。临床资料中数值型变量用均数±标准差表示，采用两独立样本t检验；分类变量用频数及百分比表示，采用χ2检验；组间等位基因频率及组间基因型比较采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。计算脑梗死组及对照组之间ICAM-1基因K469E基因型频率，确认是否符合Hardy-Weinberg平衡。

2 结 果

2.1 脑梗死组与对照组临床资料的比较 脑梗死组和对照组在对性别、年龄、体质量指数、甘油三酯、低密度脂蛋白进行比较时差异无统计学意义(P>0.05，表1)，而在收缩压、舒张压、胆固醇、空腹血糖、同型半胱氨酸之间进行比较时差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 脑梗死组和对照组一般临床参数的比较Tab.1 Comparison of general clinical data of the patients in cerebral infarction group and control group

2.2 SNP基因位点分型

2.2.1 PCR扩增产物 ICAM-1 K469E扩增产物为414 bp(图1)。使用限制性内切酶Bsh12361对产物进行酶切电泳(图2)，有3种基因型KE型(414 bp、252 bp、162 bp)，KK型(414 bp一条带)，EE型(252 bp、162 bp二条带)。

图1 ICAM-1基因K469E位点PCR电泳图Fig.1 PCR products electrophoresis of ICAM-1 gene K469E

图2 ICAM-1基因 K469E位点 Bsh1236I酶切电泳图Fig.2 Electrophoresis of ICAM-1 gene K469E digested by Bsh1236I enzymeM：DNA marker；1、4、6：KE基因型；3：EE基因型；2、5：KK基因型。

2.2.2 基因型测序结果 详见图3。

图3 ICMA-1基因K469E位点测序结果Fig.3 Sequence chromatograms of ICAM-1 K469E gene

2.2.3 两组间基因型及等位基因分布 符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有群体代表性。在脑梗死与对照组中ICAM-1基因K496E位点基因型及等位基因频率分布情况见表2，两组基因型及等位基因之间比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2.4 不同类型脑梗死患者基因型和等位基因频率的分布 大动脉粥样硬化(LAA)型脑梗死基因型频率KK 0.632、KE 0.250、EE 0.118，小动脉闭塞(SAO)型脑梗死基因型频率KK 0.683、KE 0.192、EE 0.125，两组基因型比较，差异无统计学意义(χ2=0.864，P=0.649)，LAA组K等位基因频率0.757、E等位基因频率0.243，SAO组K等位基因频率0.779、E等位基因频率0.221，两组间比较，差异无统计学意义(χ2=0.245，P=0.620，表3)。

表2 两组间基因型和等位基因频率的分布Tab.2 Distribution of different genotypes and allele frequencies

表3 不同类型脑梗死患者基因型和等位基因频率的分布Tab.3 The genotype frequency and allele distribution in patients with different types of cerebral infarction

3 讨 论

ICAM-1属于免疫球蛋白超家族成员之一，主要表达于活化的内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞以及平滑肌细胞表面，分子质量为80～114 ku。ICAM-1可介导单核细胞粘附于内皮细胞，进入血管内膜层，表达更多的细胞炎症因子，促使大量的单核细胞进入斑块内，促进动脉粥样硬化的发生和发展[9]。脑梗死主要的病因系动脉粥样硬化，为进一步明确病因，探讨与炎症有关的因子及其基因多态性成为脑梗死病因研究的热点。有研究表明，在脑梗死急性期血浆sICAM-1水平较健康对照组明显升高，sICAM-1还可能是脑梗死预后的炎症标志物，血浆中sICAM-1水平与ICAM-1 基因型有关[10]。人类ICAM-1基因定位在19 p13.3～p13.2，有两个单核苷酸多态性，其一为第4外显子的12959G>A多态性编码第3结构域的Gly241/Arg241(G241R)，其二为第6外显子的13848A>G多态性编码第5结构域的LYS469/Gly469(K469E)[11]。本课题组曾对新疆哈萨克族ICAM-1基因G241R进行基因检测，发现脑梗死组和健康对照组之间基因型及等位基因频率无统计学差异，没有证实ICAM-1 G241R多态性与新疆哈萨克族脑梗死有关[12]。国际上著名的社区动脉粥样硬化风险研究(ARIC)是有14 595例患者参与的前瞻性队列研究，VOLCIK等[13]入选13 491例研究对象，有517例发生脑梗死，对参与者进行ICAM-1基因K469E、G241R检测发现，脑梗死组中ICAM-1基因G241R位点RR和GR基因型频率高于对照组，R等位基因是脑梗死的一个重要预警指标。在所研究的黑人和白种人群中，ICAM-1基因K469E位点基因型频率在脑梗死组与健康对照组之间无统计学差异。国内韦叶生等[14]对广西壮族195例脑梗死患者、210例健康对照组进行ICAM-1基因K469E位点基因检测，发现E等位基因携带者患脑梗死的风险是K等位基因的1.454倍，ICAM-1 K469E位点E等位基因是广西壮族人脑梗死患者的遗传易感基因。LI等[15]对汉族309例脑梗死患者和309例健康对照组进行ICAM-1基因K469E位点检测，发现EE、EK是导致女性脑梗死的危险因素，与男性脑梗死发生无相关性。WANG等[16]对大连地区汉族脑梗死患者进行ICAM-1基因K469E位点检测发现，KK基因型是急性脑梗死的危险因素。本课题组研究发现，ICAM-1基因K469E位点在哈萨克族人群呈多态性分布，K等位基因是新疆哈萨克族脑梗死易感基因，KK基因型携带者可能更易患脑梗死。出现不同的结果考虑与所研究对象的生活环境及种族差异有关。

本研究脑梗死组与对照组在体质量指数、甘油三酯、低密度脂蛋白比较时，差异无统计学意义；在收缩压、舒张压、胆固醇、空腹血糖、同型半胱氨酸两组间比较时具有统计学差异。考虑这与哈萨克族独特的生活习惯有关，他们日常生活多以熏肉为主，蔬菜、水果摄入量较少，且喜饮咸奶茶等造成了哈萨克族人腹型肥胖比例高，高血压占有比例大，系脑梗死高发人群。哈萨克族人生活在新疆北疆山区，以游牧为主，很少与外界通婚，生活较为封闭，为基因测定研究提供了良好的基础。国际上大型实验亦选取ICAM-1基因位点的多态性作为脑梗死易感基因的候选基因，故本课题组在原有基础上进一步扩大样本量，对新疆哈萨克族ICAM-1基因K469E位点进行检测，ICMA-1基因多与炎症相关，故通过TOAST分型，选取与炎症关系密切的大动脉粥样硬化型、小动脉闭塞型脑梗死患者进行基因型及等位基因检测。结果发现大动脉粥样硬化型脑梗死KK占63.2%，小动脉粥样硬化型脑梗死KK基因占68.3%，二者之间无统计学差异。在两种类型的脑梗死中，K及E及等位基因之间无统计学差异，这说明ICAM-1基因可能在大动脉粥样硬化型脑梗死及小动脉闭塞型脑梗死的发病机制中均起作用，没有过高的选择性，但要进一步证实仍需扩大样本量及行相关类型血管内皮细胞基因测定。

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(编辑 卓选鹏)

Correlation between polymorphism of intercellular adhesion molecule-1 K469E gene and different types of cerebral infarction in Kazaks minority ethnic population of Xinjiang

GENG Yu-rong, CHEN Xin-xin, Ren Hong-qiang

(Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Medical College,Shihezi University, Shihezi 832002, China)

Objective To explore the distribution of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) K469E gene among Kazak people in Xinjiang and its correlation with different types of cerebral infarction. Methods Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism methods were used to analyze the polymorphism of ICAM-1 gene K469E from 180 Xinjiang Kazak patients with different types of cerebral infarction (cerebral infarction group) and 180 healthy people (control group). Results The frequencies of K allele of ICAM-1 gene K469E in cerebral infarction group were significantly different from those in control group (χ2=8.455,P=0.004). The frequencies of KK genotype in cerebral infarction group were significantly different from those in control group (χ2=15.50,P=0.000). Large artery atherosclerosis (LAA) type cerebral infarction genotype frequency was KK 0.632, KE 0.250, and EE 0.118. Small artery occlusion (SAO) type cerebral infarction genotype frequency was KK 0.683, KE 0.192, and EE 0.125. The two groups with the same genotypes showed no significant difference (χ2=0.864,P=0.649). In LAA group, K allele frequency was 0.757 and E allele frequency 0.243; in SAO Group, K allele frequency was 0.779 and E allele frequency 0.221. The two groups revealed no obvious difference (χ2=0.245,P=0.620). Conclusion The polymorphism of ICAM-1 gene K469E is associated with cerebral infarction in Kazaks people in Xinjiang. Its K allele may be the genetic susceptibility gene for cerebral infarction in Kazaks people in Xinjiang.

intercelluar adhesion molecule-1; K469E; gene polymorphism; cerebral infarction

2016-04-29

2016-07-10

国家自然科学基金资助项目(No.81160368)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.8116036)

任宏强. E-mail: 455952229@qq.com

743.33

A

10.7652/jdyxb201606010

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160903.1027.002.html(2016-09-03)