黎 韡，徐勤鸿，马清涌

(西安交通大学第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061)



◇基础研究◇

高糖状态对胰腺癌细胞氧化应激水平的促进作用

黎 韡，徐勤鸿，马清涌

(西安交通大学第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061)

目的 研究高浓度葡萄糖对胰腺癌细胞株BxPC-3活性氧(ROS)及抗氧化酶水平的影响。方法 用DCFH-DA荧光探针检测细胞ROS水平；用过氧化氢(H2O2)试剂盒检测细胞内H2O2水平；用不同抗氧化酶试剂盒检测细胞中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性；用Western blot方法检测细胞中SOD1和SOD2蛋白水平表达；通过siRNA技术下调SOD2的表达，研究H2O2的生成与SOD的关系。结果 胰腺癌细胞在不同浓度葡萄糖培养基中培养后，细胞内ROS水平及H2O2水平明显升高，并呈现浓度依赖性(P<0.05),甘露醇对氧化应激水平无明显影响；高糖状态可以明显提高细胞中T-SOD及CAT活性(P<0.05)，而对GPX活性无明显影响；与正常浓度葡萄糖组相比，高浓度葡萄糖可明显升高细胞SOD2蛋白表达水平，而对SOD1蛋白表达无明显影响；siRNA组SOD2蛋白表达水平显著下降(P<0.05)，下调SOD2表达可明显降低高糖状态所调控的H2O2水平。结论 高浓度葡萄糖可明显提高胰腺癌细胞氧化应激水平，H2O2的产生与SOD2的升高存在一定联系。

高糖；活性氧；过氧化氢；超氧化物歧化酶；胰腺癌

胰腺癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，由于其早期缺乏明显的症状及诊断水平的局限性，大多数患者确诊时已处于不可逆转的晚期。因此，胰腺癌生物学行为的研究对疾病的治疗及预后尤为关键。氧化应激是机体活性氧(ROS)与抗氧化物质的一种失衡状态。ROS是由氧气所衍生的多种化学活性分子的统称，其主要包括超氧阴离子、过氧化氢(H2O2)及羟自由基等。当ROS水平超过抗氧化物的调节能力时，机体处于氧应激状态。ROS对肿瘤存在正反两方面影响：高浓度ROS可诱发肿瘤凋亡，抑制肿瘤增殖；当ROS不足以杀伤肿瘤细胞时，其可参与肿瘤基因转录调控，促进肿瘤增殖、侵袭和转移[1]。机体抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)。

糖尿病是以高血糖为特征的慢性疾病，其发病机制与胰岛素分泌相对不足及胰岛素抵抗相关。糖尿病不仅是胰腺癌的重要促进因素和危险因素，也是胰腺癌的独立预后因素。85%的胰腺癌患者存在不同程度的糖耐量异常甚或存在糖尿病；50%的胰腺癌患者在确诊时发现合并有糖尿病，其中半数糖尿病患者属于新发糖尿病[2]。本研究选用人胰腺癌BxPC-3细胞株，通过不同葡萄糖浓度培养基干预，观察细胞ROS及抗氧化酶水平的变化，从新的角度探讨胰腺癌与糖尿病之间的关系，揭示高糖状态促进细胞内氧化应激产生的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人胰腺癌细胞BxPC-3购于美国ATCC；DMEM(低糖型，美国GIBCO公司)；葡萄糖(美国Sigma公司)；胎牛血清(美国HyClone公司)；ROS检测试剂盒、H2O2检测试剂盒、CAT检测试剂盒、GPX检测试剂盒、T-SOD活性检测试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)；小干扰RNA合成(si-SOD2)(上海吉玛制药技术有限公司)；SOD1、SOD2抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 BxPC-3细胞培养于含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM低糖培养液中，置于含50 mL/L CO2、37 ℃恒温饱湿培养箱中，1～2 d更换新鲜培养基一次，当细胞量达到80%～90%时进行细胞传代。

1.2.2 细胞中ROS含量的测定 将贴壁生长的BxPC-3消化、离心后重悬，按每孔6×105加入6孔细胞培养板中，加入不同干预因素，置恒温培养箱中培养。用培养基(无血清)按照1∶1 000稀释DCFH-DA，终浓度10 μmol/L。去除待检测细胞中的培养液，加入稀释好的DCFH-DA(1 mL/孔)。在37 ℃细胞培养箱中孵育15～20 min，用无血清细胞培养液洗涤、并应用胰酶消化细胞后，无血清培养基重悬。待测样本采用488 nm激发波长、525 nm发射波长于流式细胞仪下检测。

1.2.3 细胞中H2O2含量的测定 将BxPC-3细胞收集到离心管内，弃上清液，按照1×106个细胞加入100 μL H2O2检测裂解液的比例置入细胞裂解液，随后充分匀浆并裂解细胞，低温离心机离心后留取上清液后续测定。稀释标准溶液(0、25、50、100、200、400 μL)，进行标准曲线的测定。取96孔细胞培养板，每孔加入50 μL样品或标准品，并加入100 μL H2O2检测试剂。酶标仪测定A560，并根据标准曲线计算出样品中H2O2的浓度。

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湿式诱捕器投放高度20、40、60 cm处理诱捕茶尺蠖成虫总量分别为321、158和148头，平均每台为 80.25、39.50 和 37.00 头，可见高度 20 cm 处理诱捕量最多，并与其他2个处理均达到显著差异，高度40和60 cm处理诱捕效果相当，因此，湿式诱捕器在茶园的最优投放高度为20 cm。

1.2.4 细胞中T-SOD活性的检测 用细胞裂解液按照每1×106个细胞加入200 μL细胞裂解液的比例进行BxPC-3细胞裂解。按照试剂盒要求，依次配制WST工作液及酶工作液，待测样品中依次加入对照溶液、WST工作液、酶工作液并充分混匀。37 ℃恒温箱中孵育20 min，在450 nm测定吸光度。按以下公式先计算抑制率，再计算SOD酶活力单位。

随着高等教育改革的迅速发展，高校学生管理不再受限于教育部下发的学生管理体制和规定，而是站在学生的角度进行服务和管理，从心理、生理、兴趣爱好、知识储备等多个方面进行思考，由此把握学生的思想动向，进行教育管理。当代大学生不仅是受教育者的身份，他与管理者具有平等的地位和权利。因此，高校管理应该运用科学的管理理念和方法，将学生的日常生活和思想教育相结合，不断优化学生的各项管理工作，从学生的角度入手，保护学生的权利，凸显学生管理的实效性和科学性。

式中，α=2πr/λ为粒子的尺度参量，n为粒子的复折射率，Qsca、Qabs和Qext分别为单个雾滴粒子的散射、吸收和消光效率因子, Qsca、Qabs和Qext可由Mie散射理论计算得出[20]

1.2.7 Western blotting蛋白印迹分析 应用裂解液将BxPC-3细胞充分裂解并提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，分别取等量蛋白加入上样缓冲液于沸水中煮5 min，于SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，电泳完毕后将凝胶上的蛋白经半干转转膜仪按(膜面积×0.8)mA恒流转印30～60 min至PVDF膜上，充分封闭后，分别加入SOD1、SOD2及β-actin抗体，4 ℃静置过夜，洗膜后再加入特定比例稀释好的二抗溶液室温孵育2 h，再次洗膜后加入发光液，于成像分析系统显像，Quantity One分析软件检测并分析条带的灰度值。

1.2.8 肿瘤细胞siRNA干扰 siRNA是一种小RNA分子，其调控机制是通过互补配对引起相应靶位基因的表达发生沉默。本实验中对BxPC-3转染了SOD2的小RNA干扰片段，从而沉默该基因。si-SOD2干扰序列见表1。

秸秆禁烧是一个综合性的系统工程，难以在短期内一蹴而就。当前，由于农民环保意识不强、秸秆回收成本较高、政府财政资金支持不足以及相关产业发展滞后等原因，秸秆禁烧推进难度比较大。因此，必须坚持疏堵结合、以疏为主的原则，促进该项工程的实施。

表1 si-SOD2干扰序列Tab.1 The interference sequences of si-SOD2

BxPC-3种植于6孔细胞培养板，当细胞密度达到约50%时，用Lipofectamine 2000转染试剂转染si-SOD2进入细胞。用稀释好的含有Lipofectamine 2000的无血清DMEM与含有siRNA的无血清DMEM培养基轻柔、充分混合，在室温下放置20 min，从而形成siRNA-Lipofectamine 2000混合物。将上述混合溶液(500 μL/孔)加入6孔细胞培养板，并加入1.5 mL无血清、无抗生素的DMEM培养基，充分混匀后放入CO2细胞培养箱继续培养。6 h后将细胞培养基换成含有血清成分及干预因素的完全培养基，继续培养48 h，提取BxPC-3细胞的总蛋白进行Western blotting分析，观察干扰效果。

其次，对于目前绩效管理机构也需要进行必要完善，促使医院绩效管理机制趋于健全、完善，建立、健全绩效管理制度以及机构，对于医院健康以及稳定发展具有重要作用，应当建立申诉制度，如果出现不公平情况应当有效处理，促使考核更加公正、公平。人力资源管理过程当中应当高度重视绩效考核。对于财务部门而言，应当给予绩效管理部门一定数据支持，这样绩效管理就可以根据财务部门提供的数据做出正确以及科学考核，另外其他部门需要制定出合理年度计划，然后交给人力资源管理部门进行审核汇总，提升人力资源管理工作质量和效率。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0进行数据的录入及统计学分析。实验结果用均数±标准差表示。两组间数据比较采用t检验，三组间数据比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

约束混凝土与无约束混凝土材料应力-应变关系采用Opensees材料库中的Kent-Park提出的Concrete01模型[6-7]，该模型是Kent等人通过大量矩形箍筋墩柱的试验提出的，并在实践中得到了广泛应用。

2 结 果

H2O2是ROS的重要成分之一。本实验进一步测定了高浓度葡萄糖对BxPC-3中H2O2产生的影响。结果显示，随着葡萄糖浓度的增加(5.5～25 mmol/L)，BxPC-3细胞产生H2O2的量明显升高(图2)，提示高糖诱导的H2O2存在浓度依赖性，且该变化不受渗透压的影响(5.5 mmol/L葡萄糖组与甘露醇对照组产生的H2O2相当)。

图1 葡萄糖对BxPC-3细胞总ROS的影响Fig.1 The effect of glucose onthe production of ROS inBxPC-3 cells

2.1 高糖对胰腺癌细胞ROS生成的影响 首先检测葡萄糖培养后BxPC-3细胞产生的ROS。BxPC-3细胞在不同浓度的葡萄糖(5.5、12.5、25 mmol/L)培养基中培养48 h，以5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇(渗透压相同)为对照，检测总ROS水平。结果显示，BxPC-3细胞产生的ROS随葡萄糖浓度的增加而递增，12.5和25 mmol/L组的ROS显著高于正常浓度葡萄糖(5.5 mmol/L)组；而对照组的ROS与5.5 mmol/L葡萄糖组无显著性差别，表明ROS的升高并非由渗透压所导致(图1)。

图2 不同浓度葡萄糖干预对胰腺癌BxPC-3细胞H2O2产生的影响Fig.2 The effect of different glucose concentrations on the production of H2O2in BxPC-3 cells

2.2 高糖对胰腺癌细胞抗氧化酶生成的影响 应用相应试剂盒对BxPC-3细胞在不同糖浓度条件下所产生的CAT、GPX及SOD进行了定量测定。结果显示，在48 h时间点，随着葡萄糖浓度的递增(5.5～25 mmol/L)，BxPC-3细胞的总SOD活力逐渐升高，葡萄糖的渗透压作用对SOD的变化无明显影响。此外，高糖状态还可以促进肿瘤细胞CAT活力的提高，鉴于高糖环境可以使胰腺癌细胞 H2O2产生增高，考虑CAT的提升可能是由于高糖诱导胰腺癌细胞生成H2O2后的一种代偿性反应。高糖环境对GPX的产生无明显影响(表2)。

表2 葡萄糖对BxPC-3 细胞抗氧化酶活性的影响Tab.2 The effect of glucose on the activities of antioxidant enzymes in BxPC-3 cells (u/mg蛋白)

为了进一步明确高糖状态对SOD1、SOD2蛋白水平的影响，用Western blotting检测不同糖浓度培养基培养48 h后BxPC-3细胞抗氧化物酶蛋白水平的变化。结果显示，高糖对SOD1表达并无明显影响，而25 mmol/L葡萄糖组的SOD2表达水平明显高于正常浓度的葡萄糖组(图3)。

图3 高糖对BxPC-3细胞SOD1、SOD2蛋白表达的影响Fig.3 The effect of hyperglycemia on the protein expressions of SOD1and SOD2in BxPC-3 cells

2.3 筛选SOD2的干扰片段 实验设计合成了3对SOD2siRNA干扰序列，编号为782(si-SOD2-1)、593(si-SOD2-2)及429(si-SOD2-3)。分别用3对SOD2siRNA干扰序列转染BxPC-3细胞，选择合适的干扰序列，转染后继续常规培养72 h，进而检测SOD2的表达，观察转染效率。结果显示，序列429(si-SOD2-3)可显著降低SOD2的蛋白水平表达，抑制率约70%，因而后续实验选择序列429(si-SOD2-3)为SOD2的干扰序列(图4)。

图4 si-SOD2对BxPC-3细胞SOD2蛋白表达的影响Fig.4 The effect of si-SOD2on the protein expression of SOD2in BxPC-3

2.4 si-SOD2对H2O2产生的负调控作用 SOD主要功能是歧化超氧阴离子生成H2O2。本部分实验通过沉默BxPC-3细胞中的 SOD2基因，观察对H2O2产生所造成的影响。选择429小RNA干扰序列转染胰腺癌细胞，随后常规培养48 h，加入不同糖浓度培养基继续干预48 h，用试剂盒定量测定H2O2的产生。结果显示，在高糖状态下(25 mmol/L)，SOD2基因的沉默可以明显下调胰腺癌细胞H2O2的生成，表明高糖诱导H2O2的生成的是由SOD所调节(图5)。

图5 SOD2基因沉默对BxPC-3细胞H2O2产生的影响Fig.5 The effect of si-SOD2on the production of H2O2in BxPC-3

3 讨 论

胰腺癌恶性程度高，早期诊断困难，易发生浸润转移，且对放化疗不敏感。此外，胰腺癌确诊时，仅有20%的患者可以接受根治性手术，5年生存率不到5%[3]。造成胰腺癌预后极差的原因主要是由于患者缺乏明显的早期临床表现，并且目前尚无高敏感性的诊断方法，胰腺癌早期诊断率仅5%～7%。患者确诊时往往已到了不可逆转的晚期，发生了局部浸润及远处转移[4]。探究胰腺癌的危险因素、发生发展机制及治疗靶点，是目前的研究热点。

关于糖尿病与胰腺癌之间的关系一直存在着争论。部分学者认为，糖尿病是胰腺癌的临床表现，糖尿病的发生可能与胰腺癌进展过程中破坏胰腺组织(胰岛细胞损伤)相关，肿瘤在发展的过程中可产生自身抗体和部分多肽，从而引起胰岛素抵抗，并加重糖尿病[5]。此外，研究发现在对伴有糖尿病的胰腺癌患者行胰十二指肠切除术后，超过半数的新发糖尿病患者血糖水平可降至正常，提示存在肿瘤诱发糖尿病的可能性[6]。另一部分学者则认为，糖尿病是胰腺癌发生的危险因素，因为大量的流行病学资料提示糖尿病状态可增加胰腺癌的罹患风险。此外，糖尿病对已发生的胰腺癌具有明显的促进作用[7]，用降糖药后肿瘤可明显抑制[8]。不可否认的是，无论糖尿病与胰腺癌孰因孰果，大约80%的胰腺癌患者确诊时存在糖耐量异常甚或糖尿病。本研究就高糖状态对胰腺癌细胞氧化应激水平的调控展开讨论。

氧化应激是机体ROS与抗氧化物质的一种失衡状态。当ROS水平超过抗氧化物的调节能力时，机体处于氧应激状态。ROS对细胞的影响存在双重作用：在正常生理情况下，ROS可以帮助机体抵御外界各种因素的刺激并可作为第二信使调控细胞生理机能；然而ROS水平过高则会诱发细胞凋亡、染色体变异、甚至肿瘤形成[9]。近年的研究发现高糖微环境可以直接激发氧应激[10]。高糖微环境诱发氧应激出现的一个关键途径即激活线粒体氧化呼吸链。BROWNLEE等[11]强调，处于高糖环境下的细胞，其无氧糖酵解产物丙酮酸及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸明显提高，由此可以导致线粒体内质子梯度的增高及后续ROS的生成。高糖微环境可通过多条途径促进 ROS产生：在生理条件下，葡萄糖经糖酵解及氧化磷酸化代谢可产生ROS；而在高糖环境中，糖酵解及甘油醛分解代谢受到不同程度影响，由此导致葡萄糖、二磷酸果糖及三磷酸甘油醛通过山梨醇代谢途径、氨基己糖通路、PKC活化、丙酮醛途径、甘油自氧化及氧化磷酸化等过程代谢并导致ROS的生成[12]。此外，高糖状态在诱导ROS生成的同时可以引起线粒体形态学及动力学改变：线粒体聚变减少，裂变增多。而线粒体碎片的出现可进一步影响氧化代谢，增加ROS产生，出现恶性循环[13]。

本实验结果显示，高糖状态可以促进BxPC-3细胞总ROS及H2O2的产生，而H2O2生成的增多可能与高糖诱导的SOD2分泌加强相关。尽管同样作为抗氧化酶系列，SOD与CAT、GPX作用相反，SOD可通过歧化作用加速H2O2的产生，而CAT、GPX可分解H2O2生成水和氧气。实验中，我们通过检测抗氧化酶的活性及蛋白表达水平，发现高糖状态可以提高SOD2的产生进而增加H2O2的含量，而CAT的提升可能为细胞的一种代偿性反应。

1.2.5 细胞中CAT活力的检测 用细胞裂解液裂解BxPC-3细胞，使蛋白终质量浓度为0.2 mg/mL。按照试剂盒要求测定标准曲线后，取裂解液5 μL至1.5 mL EP管中，加入CAT检测缓冲液至体积为40 μL，充分混匀后加入250 mmol/L H2O2溶液10 μL，25 ℃反应5 min后加入CAT反应终止液450 μL。另取EP管，内加40 μL CAT检测缓冲液，再加入10 μL已终止的上述反应体系，混匀后取10 μL加入到96孔板中，并加入200 μL H2O2显色工作液。25 ℃恒温箱中孵育20 min后测定A520。根据以下公式计算肿瘤细胞样品中CAT活力：

近年来，大量文献指出，抗氧化酶对ROS的清除作用可以抑制肿瘤侵袭转移。SHIMOJO等[14]发现处于缺氧环境的胰腺癌细胞株Panc-1及MIA PaCa-2所产生的ROS增多，并伴随着上皮-间质转化(EMT)的发生及肿瘤侵袭能力的提高，当给予抗氧化酶N-乙酰半胱氨酸干预后，缺氧状态对肿瘤细胞的EMT诱导作用被明显抑制。LEWIS等[15]发现胰腺癌腹水转移株Capan-1表达SOD1及SOD2的水平明显较原发细胞株MIA PaCa-2高。而应用SOD直接干预肿瘤细胞，由于H2O2的产生，肿瘤细胞侵袭、迁移能力可以明显提高[16]。作为重要的H2O2清除剂，CAT不仅可以抑制肿瘤转移，而且可以提高肿瘤细胞对化疗的敏感性[17]。

1.2.6 细胞中GPX活性的检测 裂解后的BxPC-3细胞按照试剂盒要求，在96孔板中依次加入GPX检测缓冲液、待测样品和GPX检测工作液，充分混匀后加入过氧化物试剂溶液，震荡混匀。用酶标仪连续测定3 min A340；按公式计算样品GPX活力：

总之，本实验结果表明，高浓度葡萄糖可以明显升高胰腺癌细胞ROS及H2O2水平，其中H2O2的产生与SOD2的升高有关。高糖微环境是否可通过H2O2的产生影响肿瘤发生、发展以及相关信号通路仍需进一步研究。本实验以氧应激为中心，将胰腺癌与糖尿病相关联，为合并糖尿病的胰腺癌患者治疗提供一种新的思路。

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(编辑 卓选鹏)

Journal of Pharmaceutical Analysis 征稿启事

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Brown等[26]认为ECTR和OCTR是治疗腕正中神经压迫的两种方法，对145例患者进行了169手的前瞻性、随机、多中心研究。他们得出结论无论是开放性还是内窥镜腕管松解术都取得了较好的效果，但ETCR引起4例并发症要高于常规手术。他们认为此差异是由于ETCR手术相对常规手术需要更长的时间来熟练掌握，需要通过加强培训来减少并发症的发生。

High glucose promotes oxidative stress in pancreatic cancer cells

LI Wei, XU Qin-hong, MA Qing-yong

(Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To investigate the effects of high glucose on the levels of reactive oxygen species (ROS) and antioxidant enzymes in pancreatic cancer cell line BxPC-3. Methods After BxPC-3 cells were cultured in different concentrations of glucose, their intracellular ROS level determined using 2,7-dichlorodihydrofluorecein diacetate. The level of intracellular hydrogen peroxide (H2O2) was measured using H2O2assay kit. The activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPX) were detected by different antioxidant enzyme analysis kits. The protein levels of SOD1and SOD2were measured by Western blot. The effect of small interfering RNA (siRNA) knockdown of SOD2on the level of H2O2was also tested in pancreatic cancer cells. Results The production of ROS and H2O2was increased by glucose in a concentration-dependent manner (P<0.05). Addition of mannitol, an osmosis regulator, did not affect the levels of ROS and H2O2. Hyperglycemia could increase the activities of T-SOD and CAT as well as the protein expression of SOD2(P<0.05). SOD2siRNA was successfully transfected into BxPC-3 cells, resulting in the inhibition of SOD2protein expression (P<0.05). Down-regulation of SOD2significantly decreased hyperglycemia-induced H2O2level. Conclusion Hyperglycemia can increase ROS level in pancreatic cancer cells. The production of H2O2is related to SOD2level.

high glucose; ROS; H2O2; SOD; pancreatic cancer

2016-03-18

2016-04-21

国家自然科学基金资助项目(No.81301846)

Supported by the National Natural Science Foundation of China ( No.81301846)

马清涌. E-mail: qyma56@mail.xjtu.edu.cn

R735.9

A

10.7652/jdyxb201606004

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