文强，张红，马云波

(临沂市人民医院，山东临沂276000)



文强，张红，马云波

(临沂市人民医院，山东临沂276000)

1 材料与方法

1.1 材料 实验菌株：结核杆菌菌株29株，均从结核病患者痰液中分离；标准结核杆菌菌株(H37Rv ATCC27924)1株，购自卫生部临床检验室。96孔板，美国Corning公司。SMX、甲氧苄啶(TMP)、链霉素(S)、H、利福平(R)、乙胺丁醇(E)、卡那霉素(Km)、氧氟沙星(Ofx)、利福布丁(Rfb)，美国Sigma公司。二甲基甲酰胺(DMF)、吐温-80及氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 药物敏感试验 采用绝对浓度法。从痰液中分离结核杆菌，标准培养；挑取结核杆菌菌落，置于玻璃磨菌器内，研磨后加0.5%吐温-80生理盐水稀释，配制成1 mg/mL菌悬液；进一步稀释10倍后，取0.1 mL接种于含药培养基(SMX、TMP、S、H、R、E、Km、Ofx、Rfb绝对浓度法专用培养基)及对照培养基(不含药)中，培养4周观察结果。如结核菌落生长“+”及以上为耐药。其中多重耐药(MDR，对以上2种或以上抗结核药同时耐药)菌株6株、非MDR株 9株、敏感株15株。

1.2.2 抗结核药最低抑菌浓度(MIC)确定 采用微孔板Alamar blue法，具体步骤参照文献[10～12]，药物终浓度：SMX为0.63～160 μg/mL；TMP为0.125～32 μg/mL； TMP ∶SMX=1 ∶19时为0.03/0.6～4/76 μg/mL；R为0.07～8.00 μg/mL；H为0.013～1.600 μg/mL；S为0.13～16.00 μg/mL；E为0.31～40.00 μg/mL；Km为0.31～40.00 μg/mL；Ofx为0.13～16.00 μg/mL；Rfb为0.03～4.00 μg/mL。SMX、TMP、R、Rfb用DFM溶解，H、S、E、Km用水溶解，Ofx用1%氢氧化钠溶解。根据药物终浓度中最高浓度基数进行2倍稀释，每种药物包括8个浓度梯度，每种药物浓度重复2孔。同一浓度梯度下，每个菌株均取1个阳性对照孔(不含药物，只含菌液)和1个阴性对照孔[只含7H9(米氏)分枝杆菌培养基，不含药物和菌液]，各菌株平行测定2次。在阳性对照孔中加入吐温-80及Alamar blue的混合液孵育24 h，由蓝色变为粉红色后，在各药物孔中加入上述混合液，孵育24 h，观察颜色变化，粉红色为生长，蓝色为不生长。阻止颜色(由蓝色变为粉红色)变化的最低药物浓度，即为MIC。SMX与S、H、R、E、Km、Ofx、Rfb联合用药时的MIC同法测定。

1.3 药物相互作用效果判定 药物相互作用以分级抑菌浓度(FICI)表示，FICI=甲药联用MIC/甲药单用MIC+乙药联用MIC/乙药单用MIC(SMX为甲药，其他抗结核药物为乙药)，FICI≤0.5为协同作用，0.5

2 结果

2.1 结核杆菌对TMP ∶SMX=1∶19、SMX、TMP的体外MIC 见表1。

表1 结核杆菌对TMP∶SMX=1∶19、SMX、TMP的体外MIC(μg/mL)

2.2 不同浓度SMX、TMP对结核杆菌的抑制作用 见表2。

表2 不同浓度SMX、TMP对结核杆菌的抑制作用(株)

2.3 SMX联合抗结核药物的药物相互作用效果 见表3。SMX与抗结核药物对标准菌株H37Rv的药物相互作用：SMX+S、SMX+R主要为相加作用，SMX+Rfb主要为协同作用，SMX+H、SMX+E、SMX+Km、SMX+Ofx主要为无关作用。SMX与抗结核药物对29株结核杆菌的药物相互作用效果见表3。

表3 SMX联合抗结核药物对29株结核杆菌菌株的药物相互作用效果(株)

3 讨论

近年来随着MDR-TB的出现，结核病的防治形势越来越严峻。S、R、E、H是一线抗结核药物，但目前其治疗效果并不理想。国外有研究发现，初治结核患者对以上药物耐药率分别为27.7%、6.7%、4.9%、16.0%；复治患者耐药率分别达37.2%、29.4%、17.2%、38.5%[9]。因此，寻找新的抗结核药物成为研究热点。磺胺类药物问世已有半个世纪，其为人工合成的氨苯磺胺衍生物，抗菌谱广，药物价格低廉，最初主要用于感染性疾病的治疗。随着新型抗菌药物的临床研发，磺胺类药物在临床上的应用逐渐减少。近年研究发现，磺胺类药物可抑制结核杆菌生长，其与TMP制成复方制剂(复方新诺明)抑菌效果更好[13～15]。本研究观察了TMP、SMX对结核杆菌的体外抑菌活性，结果显示，TMP∶SMX=1∶19时，MDR株的MIC与非MDR株、敏感株接近；TMP的MIC无论是否为MDR株均较高；SMX的MIC≤30 μg/mL时，对5株MDR株、8株非MDR株、14株敏感株有抑制作用，表明MIC≤30 μg/mL是SMX较为适宜的体外抑菌浓度，且与是否为MDR无关；TMP>30 μg/mL时，对6株MDR株、9株非MDR株、9株敏感株有抑制作用，表明TMP对结核杆菌的体外抑菌活性较低。

目前临床上抗结核治疗多采用联合用药[16]。本研究发现，对标准菌株H37Rv，SMX+Rfb为协同作用，SMX+H、SMX+E、SMX+Km、SMX+Ofx均为无关作用，表明上述联合用药对单一菌株的抑菌活性以无关作用为主。SMX与抗结核药物联用对29株结核杆菌的药物相互作用显示，SMX+S、SMX+H、SMX+R、SMX+E、SMX+Ofx等多表现为无关作用及拮抗作用，仅SMX+Rfb主要表现为协同作用及相加作用。

综上所述，SMX单独使用对结核杆菌的体外抑菌活性较好，但TMP单独使用体外抑菌效果较差，SMX联合Rfb时具有明显协同作用，联合其他抗结核药物多表现为无关作用。

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临沂市科技发展计划项目(201113018)。

马云波(E-mail： wagfsx@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.031

R521

B

1002-266X(2016)40-0091-03

2015-12-19)