水貂犬瘟热病毒RT-PCR检测方法建立及应用

2016-11-29于红鸽山东省即墨市畜牧兽医局266100

中国畜禽种业 2016年10期

于红鸽（山东省即墨市畜牧兽医局266100)

于红鸽（山东省即墨市畜牧兽医局266100)

水貂犬瘟热病毒 (Canine distemper virus，CDV)属于副黏病毒科 (Paramyxoviridae)麻疹病毒属 (Morbillivirus)。形状多种，病毒直径大小多在150～300nm[1]。本实验通过RTPCR技术检测了水貂病料中犬瘟热病毒的感染情况，建立具有快速、灵敏的RT-PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 参考毒株

犬瘟热CDV-3弱毒株。

1.1.2 试剂

DNAzol Regent、TRIzol LS?Reagent、RNA提取试剂盒；rTaqDNA ploymerase、 dNTPs、 AMV Reverse Transcriptase、Rnase-Inhibitor、 DNA Marker（DL2000）； Agarose 琼脂糖；异丙醇、无水乙醇、DEPC水、氯仿、琼脂粉等。

1.1.3 仪器设备

超净工作台、台式高速冷冻离心机、PCR扩增仪（Alpha Unit Black Assembly PCR、PTC-200）、42℃可调恒温水浴锅、高速离心机、微波炉、电子天平、DYY-Ⅲ-7型、DYY-Ⅲ-8B核酸电泳仪、紫外凝胶成像系统[2]。

1.1.4 检测的组织病料来源及病料采集方法

某新建貂场饲养水貂1600只，其中44日龄断奶幼貂1100只，2016年4月23日突然发病176只，死亡114只。

无菌操作剪取1.0～2.0g病料，加少量灭菌PBS(含青霉素、链霉素)，注意边研磨边加液氮，防止RNA被降解。用PBS按1∶4稀释成悬液，-20℃反复冻融3次，4℃10000r/min离心10min，取上清，-70℃保存。

1.2 方法步骤

1.2.1 引物设计与合成

根据GenBank中CDV-3N蛋白基因序列，用Primer软件设计了特异性引物，扩增引物：CDV-3-P1（5′TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT3′）； CDV-3-P2 （5′CCGCACCTTCGGATATACTG3′）。

1.2.2 CDV的RNA提取

1.5ml离心管中加入 250μl组织液；加 TRIzol LSR Reagent750μl，颠倒 6～8 次，4℃静止 5min；加 200μl氯仿充分震荡，在4℃冰箱，静止10min；4℃离心12000转15min；取上清液500μl，转入新EP管，加等量的异丙醇，颠倒6～8次（-70℃冰箱中静置45min），充分沉淀核酸；4℃离心12000转15min，弃上清液；加入75%冷乙醇（DEPC配置）1000μl，离心5min，弃上清液，干燥核酸；加20μlDEPC水溶解-20℃保存，备用。

1.2.3 CDV RNA的反转录

CDV反转录反应 (RT-PCR)总体积为 20μl：5×Buffer4μl，M-MLV(反转录酶)0.5μl，RNase inhibitor 0.5μl，RT 引物 1μl，2.5mM dNTP2.5μl，DEPC 灭菌水 8.5μl，病毒RNA模板3μl，混匀42℃水浴1h，70℃5min灭活反转录酶。得到cDNA模板，-20℃保存备用。

1.2.4 CDV PCR的反应条件的优化及体系的建立

最适模板量确定：分别以2、3、4、5、6、7和8μl反转录的cDNA为模板，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，保持其他试剂浓度及反应条件不变，确立最佳模板浓度。最适引物浓度确定：在PCR反应体系中分别加入上、下游引物（20μmol/μl） 0.1、 0.3、 0.5、 0.7、 1.0μl，通过琼脂糖凝胶电泳进行对扩增产物观察，确立最佳引物浓度。最佳退火温度确定：分别以47、49、51、53、55和 57℃退火温度进行PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳进行对扩增产物的观察，确立最佳退火温度。CDV最佳反应体系：总体积25μl，10×Buffer2.5μl，dNTP Mixture(2.5mmol/L)2μl，P1+P2 0.5μl+0.5μl，Taq0.5μl，灭菌双蒸水 17μl，DNA 模板 2μl。最佳扩增条件：95℃预变性 5min，94℃变性 30s，51℃退火 40s，72℃延伸2min，共30个循环，72℃终延伸10min。

在PCR仪中进行扩增：95℃预变性5min；94℃变性30s，51℃退火40s，72℃延伸2min，循环数30次；72℃终延伸10min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳：用TAE缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，琼脂糖加热溶化后加入溴化乙锭（EB，10mg/ml）至终浓度0.5μg/μl，混匀，制成电泳凝胶板待用。取3μl扩增产物加3μl6×Loading Buffer（上样缓冲液）混匀，加入上样孔，同时以标准DNA分子量（DL-2000 Marker）为对照，100V电泳30min，紫外凝胶成像系统观察分析结果。

1.3 CDV PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验

1.3.1 RT-PCR特异性试验

分别取犬瘟热病毒（CDV）、犬冠状病毒（CCV）反转录产物及犬细小病毒（CPV）抽提的DNA，用已建立的方法进行扩增，验证本方法的特异性。

1.3.2 RT-PCR敏感性试验

从疫苗中抽提CDV-3的RNA，用DEPC水将RNA依次进行10-1～10-7倍稀释，分别进行RT-PCR检测，确定其敏感性。

1.3.3 RT-PCR重复性性试验

用已建立的RT-PCR检测方法对用免疫胶体金试纸跟RT-PCR同检测为水貂犬瘟热病毒为阳性的病料进行重复检测3次，验证本方法的重复性和稳定性。

1.4 RT-PCR的临床应用

从储存水貂病料中随机取2份病料，分别用胶体金和RT-PCR方法检测。

2 结果

2.1 RT-PCR检测方法反应条件的确定

以CDV-3株为模板，利用设计的特异性引物进行RTPCR反应。显示扩增得到与预期目的条带大小相符的特异性片段。经过不同条件，优化PCR反应体系，确定采用2μl的模板量，上、下游引物各0.5μl，退火温度为51℃进行扩增。以优化的PCR反应的最佳条件进行PCR扩增并进行凝胶电泳，在287bp处得到清晰可见的目的条带。