龙 潺 唐雪元 郑方英 王春莲 胡 俊

(惠州市第一人民医院血液科，广东 惠州 516000)



miRNA-19b 在急性淋巴细胞白血病发病中的作用机制

龙 潺 唐雪元1郑方英 王春莲 胡 俊

(惠州市第一人民医院血液科，广东 惠州 516000)

目的 探讨miRNA-19b对Notch1信号通路的调控作用及miRNA-19b调控下的Notch1信号通路在急性淋巴细胞白血病发病中的作用及机制。方法 Real-time PCR法检测急性淋巴细胞白血病中miRNA-19b和Notch1信号通路相关分子的表达水平。分别利用miRNA-19b前体片段及miRNA-19b anti-sense片段过表达及干扰miRNA-19b的表达，MTT法检测miRNA-19b过表达及干扰对急性淋巴细胞白血病患者单个核细胞数量的变化，同时利用Western印迹法检测miRNA-19b过表达及干扰后Notch1信号通路的激活水平。 结果 (1)急性淋巴细胞白血病中miRNA-19b和Notch1信号通路相关分子Notch1及Hes5的表达水平较正常对照组显著升高(P<0.05)。(2)miRNA-19b过表达及干扰后MTT结果显示miRNA-19b可上调急性淋巴细胞白血病中单个核细胞的数量。(3)Western印迹检测显示miRNA-19b过表达可促进Notch1信号通路中Notch1及Hes5的表达，而miRNA-19b干扰后两分子的表达水平下调。结论 miRNA-19b通过激活Notch1信号通路促进急性淋巴细胞白血病的发病。

miRNA-19b；急性淋巴细胞白血病；Notch1信号通路

在过去的几十年中，尽管急性淋巴细胞白血病的标准化疗已经取得了显著进展，但是化疗药物的耐药及治疗相关的死亡率仍是治疗失败及效果欠佳的重要原因〔1〕。目前已有大量研究阐明了miRNAs异常表达和肿瘤细胞的增殖、转移、分化、凋亡、造血、血管生成有关〔2～4〕。同时，miRNAs同样参与造血系统恶性肿瘤的发病及耐药，如miRNA-126的过表达与老年急性粒细胞白血病患者的不良预后相关，同时它还参与白血病干细胞的长期维持和自我更新〔5〕。抑制miRNA-21及miRNA-19b可以降低体外白血病细胞集落形成能力及减弱体内的白血病初始细胞活性达到治疗白血病的目的。Notch1信号通路不仅可以调控正常组织的生长和发育，其激活水平异常时亦可促进肿瘤的形成。有研究表明，miRNA-19b可参与调控Notch1信号通路的激活水平〔6〕，但是对于miRNA-19b调控下的Notch1信号通路在急性淋巴细胞白血病中的作用目前尚不清楚。本研究旨在探究miRNA-19b对Notch1信号通路的调控作用以及miRNA-19b调控下的Notch1信号通路在急性淋巴细胞白血病中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 病例来源及资料 24例急性淋巴细胞白血病患者选自2011年5月至2016年5月我院血液科，依据骨髓细胞形态学及免疫表型检查得到确诊，且所有入组者均为初治的白血病患者。对照组选择我院健康体检门诊体检者20例，所有入组者近期均无感染、出血以及服用免疫抑制剂。收集所有入组者的病例资料及相关信息，抽血前向患者说明实验目的和研究性质，并签署患者知情同意书。

1.2 试剂和材料 淋巴细胞分离液购自GE公司。TRIzol购自Thermo公司；M-MLV逆转录试剂盒购自Invitrogen公司；实时荧光定量PCR荧光染料SYBR Green Supermix购自美国BIO-RAD公司；miRNA-19b、Notch1及Hes5、β-actin 扩增引物均由上海杰李公司合成，引物序列见表1。miRNA-19b前体片段、miRNA-19b anti-sense片段及阴性对照片段均购自Ambion公司，且经上海生工公司测序鉴定。

表1 实时荧光定量PCR引物

1.3 淋巴细胞分选及培养 抽取入组者外周血3～5 ml(肝素抗凝)，利用Hypaque-Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，操作步骤根据GE公司说明书指示进行。将分离得到的淋巴细胞用RPMI 1640培养基洗涤并制作为细胞悬液(2×107/ml)并培养于RPMI 1640培养液中，培养基中添加20%胎牛血清、100 μg/ml青霉素 、100 μg/ml链霉素、2 mol/L谷氨酰胺、1 mol/L丙酮酸钠，然后提取RNA和蛋白，检测相关基因的表达水平。

1.4 miRNA-19b在B淋巴细胞中过表达及干扰 在B淋巴细胞中转染miRNA-19b前体片段、miRNA-19b anti-sense片段及阴性对照片段，作为过表达组、干扰组和对照组。转染方法按照Life technology公司的Lipo 2000说明书指示。转染48 h后,提取细胞总RNA进行实时荧光定量PCR检测miRNA-19b过表达及干扰情况。

1.5 MTT法检测miRNA-19b表达变化对B淋巴细胞数量的影响 检测miRNA-19b前体片段、miRNA-19b anti-sense片段转染后B淋巴细胞数量的变化，参照MTT试剂盒说明书指示进行操作。最后在酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的吸光值，计算细胞的相对数量。

1.6 Western印迹检测miRNA-19b对B淋巴细胞中Notch1信号通路的影响 在B淋巴细胞中过表达组及干扰miRNA-19b后,提取细胞总RNA进行Western印迹，检测Notch1信号通路的改变。Western印迹步骤包括细胞蛋白抽提，蛋白样品处理，蛋白样品电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、胶片的压片检测、凝胶图像分析。

2 结 果

2.1 急性淋巴细胞白血病患者miRNA-19b的表达 急性淋巴细胞白血病组单个核细胞中miRNA-19b的表达水平普遍高于对照组(P<0.05)，表明miRNA-19b可能在急性淋巴细胞白血病的发病中具有一定作用。

2.2 急性淋巴细胞白血病中Notch1信号通路的表达 急性淋巴细胞白血病组单个核细胞中Notch1及下游分子Hes5的表达较对照组显著升高，表明急性淋巴细胞白血病中伴有Notch1信号通路的激活。

2.3 miRNA-19b在B淋巴细胞中过表达及干扰水平

2.4 miRNA-19b过表达及干扰对B淋巴细胞数量的影响 miRNA-19b过表达后细胞活性明显升高，间接表明B淋巴细胞数量较对照组明显升高(P<0.05)；而干扰miRNA-19b的表达后B淋巴细胞活性较对照组显著降低，表明miRNA-19b对B淋巴细胞的活性及数量有一定的调控作用。

2.5 miRNA-19b对B淋巴细胞中Notch1信号通路的影响 在急性淋巴细胞白血病中伴有miRNA-19b和Notch1信号通路相关分子表达的上调。miRNA-19b过表达后Notch1和Hes5的表达升高，而miRNA-19b干扰后上述蛋白水平则显著下降，与对照组比较有统计学差异(P<0.05)，表明miRNA-19b可激活B淋巴细胞中的Notch1信号通路。见图1。

图1 miRNA-19b对B淋巴细胞中Notch1信号通路的影响

3 讨 论

MiRNA是一类小的非编码RNA，能够通过结合在其mRNA的3'端的UTR区域，负调控靶基因的表达，引起翻译的抑制及mRNA的降解。已有研究表明miRNA参与造血系统恶性肿瘤的发病及耐药，如miRNA-320a的过表达与老年急性淋巴细胞白血病患者的不良预后相关〔7〕。抑制miRNA-21及miRNA-196b可以降低体外白血病细胞集落形成能力及减弱体内的白血病初始细胞活性达到治疗白血病的目的〔8〕。同时Chen等〔9〕的报道指出CXCR4通过下调LET-7a可以引起急性淋巴细胞白血病化疗药物的耐受性。

miRNA-19b被认为是肿瘤促进因子，可以促进肿瘤的增殖并抑制肿瘤细胞的凋亡〔10〕，在非小细胞性肺癌中miRNA-19b的表达升高，且与肿瘤的病理分级和TNM分期相关〔11〕。在慢性淋巴细胞白血病患者的治疗中，表观遗传转录的沉默导致癌基因转录因子PLAG1的过表达可以引起miRNA-19b表达下调，抑制白血病细胞的凋亡〔12〕。愈来愈多的证据指出miRNA-19b可以参与到白血病细胞的增殖迁移中〔13〕。Notch1信号通路是造血微环境中细胞与细胞之间通讯的主要信号通路之一，不仅可以参与到正常组织的生长和发育，在信号通路异常时，可以促进肿瘤的形成。已有研究已经证明，Notch1信号通路的激活可以抑制急性淋巴细胞性白血病的发生〔14,15〕，同时，miRNA-19b可能调控Notch1信号通路相关分子的表达，但是对于miRNA-19b及Notch1信号通路在急性淋巴细胞白血病中机制关联目前知之甚少，这也是本研究的重点所在。

本结果发现，在急性淋巴细胞白血病患者中miRNA-19b的表达明显升高，且Notch1及其下游分子Hes5的水平亦显著升高，表明miRNA-19b和Notch1信号通路可以参与急性淋巴细胞白血病的发病。MTT结果提示miRNA-19b过表达可以上调急性淋巴细胞白血病细胞的数量及活性，而miRNA-19b沉默则结果相反。同时，过表达miRNA-19b后Notch1及其下游分子Hes5的表达水平上调，因此笔者推测在急性淋巴细胞白血病发病中miRNA-19b的诱发作用可能是通过Notch1信号通路实现的，miRNA-19b可能促进了急性淋巴细胞白血病的发生与发展，可以作为急性淋巴细胞白血病药物研发的重要靶分子。

1 Minervina AA,Komkov AY,Mamedov IZ,etal.Advanced lymphoblastic clones detection in T-cell leukemia〔J〕.Dokl Biochem Biophys,2016;467(1):85-8.

2 Yeh CH,Moles R,Nicot C.Clinical significance of microRNAs in chronic and acute human leukemia 〔J〕.Mol Cancer,2016;15(1):1-16.

3 Dong X,Sui C,Huang K,etal.MicroRNA-223-3p suppresses leukemia inhibitory factor expression and pinopodes formation during embryo implantation in mice 〔J〕.Am J Transl Res,2016;8(2):1155-63.

4 Li Q,Wu Y,Zhang J,etal.MicroRNA-130a regulates cell malignancy by targeting RECK in chronic myeloid leukemia 〔J〕.Am J Transl Res,2016;8(2):955-67.

5 de Carvalho IN,de Freitas RM,Vargas FR.Translating microRNAs into biomarkers:what is new for pediatric cancer〔J〕?Med Oncol,2016;33(5):1-12.

6 Amin NA,Malek SN.Gene mutations in chronic lymphocytic leukemia 〔J〕.Semin Oncol,2016;43(2):215-21.

7 Lu Y,Wu D,Wang J,etal.miR-320a regulates cell proliferation and apoptosis in multiple myeloma by targeting pre-B-cell leukemia transcription factor 3 〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2016;473(4):1315-20.

8 Wang JJ,Wang ZY,Chen R,etal.Macrophage-secreted exosomes delivering miRNA-21 inhibitor can regulate BGC-823 cell proliferation〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2015;16(10):4203-9.

9 Zhang W,Sun JZ,Han Y,etal.CXCL12/CXCR4 signaling pathway regulates cochlear development in neonatal mice 〔J〕.Mol Med Rep,2016;13(5):4357-64.

10 Wang J,Song S,Xie C,etal.MicroRNA profiling in the left atrium in patients with non-valvular paroxysmal atrial fibrillation 〔J〕.BMC Cardiovasc Disord,2015;15(5):1-7.

11 Wang XC,Du LQ,Tian LL,etal.Expression and function of miRNA in postoperative radiotherapy sensitive and resistant patients of non-small cell lung cancer 〔J〕.Lung Cancer,2011;72(1):92-9.

12 Patz M,Pallasch CP,Wendtner CM.Critical role of microRNAs in chronic lymphocytic leukemia:overexpression of the oncogene PLAG1 by deregulated miRNAs 〔J〕.Leuk Lymphoma,2010;51(8):1379-81.

13 Landskroner-Eiger S,Qiu C,Perrotta P,etal.Endothelial miR-17 approximately 92 cluster negatively regulates arteriogenesis via miRNA-19 repression of WNT signaling 〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2015;112(41):12812-7.

14 Carofino BL,Ayanga B,Tracey LJ,etal.PRDM14 promotes RAG-dependent Notch1 driver mutations in mouse T-ALL 〔J〕.Biol Open,2016;5(5):645-53.

15 Rasi S,Khiabanian H,Ciardullo C,etal.Clinical impact of small subclones harboring NOTCH1,SF3B1 or BIRC3 mutations in chronic lymphocytic leukemia 〔J〕.Haematologica,2016;52(1):330-9.

〔2016-08-08修回〕

(编辑 曲 莉)

惠州市科技局资助项目(2013Y043)

1 中南大学湘雅三医院

胡 俊(1968-)，男，主任医师，主要从事白血病的发病机制研究。

龙 潺(1977-)，女，硕士， 副主任医师，主要从事白血病的发病机制研究。

R733.7

A

1005-9202(2016)19-4724-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.023