马鞭草总黄酮对肝癌HepG-2细胞凋亡的影响

2016-11-24任丽平李先佳梁树才王文宝孙民振

中国老年学杂志 2016年19期

关键词：细胞周期阴性肝癌

任丽平李先佳梁树才毛讯王文宝孙民振

(漯河医学高等专科学校药理教研室,河南漯河 462002)

马鞭草总黄酮对肝癌HepG-2细胞凋亡的影响

任丽平李先佳1梁树才1毛讯王文宝孙民振

(漯河医学高等专科学校药理教研室,河南漯河 462002)

目的探讨马鞭草总黄酮(TFV)对肝癌HepG-2 细胞增殖和凋亡的影响。方法 MTT法检测TFV对肝癌HepG-2 细胞增殖的影响，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡水平，Western 印迹法检测核因子(NF)-κB p65和IκB-α蛋白表达情况。结果与阴性对照组比较，不同浓度TFV能明显抑制HepG-2 细胞的生长(P<0.01)，呈浓度和时间依赖性。TFV作用于HepG-2 细胞24 h 后，HepG-2 G0/G1期细胞比例下降，S期和G2/M期细胞百分率增加(P<0.05)，诱导细胞凋亡效果明显(P<0.01)，能明显的降低NF-κBp65表达，升高IκB-α蛋白表达 (P<0.05)。结论 TFV能抑制HepG-2 细胞的增殖，诱导细胞凋亡，机制可能与促进IκB-α蛋白表达，下调NF-κBp65蛋白表达有关。

肝癌；HepG-2细胞；马鞭草总黄酮；细胞增殖；细胞凋亡

近年来，肝癌的发病率逐年呈上升的趋势，严重影响患者的生活质量，手术治疗及放疗、化疗等非手术治疗方案都不理想，而中医对该病的治疗取得了一定成就〔1〕。马鞭草为马鞭草科植物马鞭草的全草或带根全草，味苦性凉，具有抗癌、抗早孕和免疫调节作用。研究表明，马鞭草富含黄酮类化合物〔2〕。本研究以肝癌HepG-2细胞为研究对象，采用不同浓度马鞭草总黄酮(TFv)对人肝癌HepG-2细胞株给药，观察对人肝癌HepG-2细胞株增殖与凋亡作用的影响，探讨TFV对人肝癌细胞HepG-2细胞株抑制作用可能的机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 TFV由漯河医专天然药物化学教研室提供(纯度为90%)，溶于二甲基亚砜(DMSO)中，完全培养基稀释成不同浓度，过滤除菌4℃保存。MTT细胞增殖检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；碘化丙啶(PI)购自Invitrogen；DMEM、胰酶购自Gibco公司；其余试剂为分析纯试剂。

1.2 细胞及培养 HepG-2 细胞株由漯河医专分子生物学实验室传代保种。10%小牛血清的DMEM液中，37℃，5%CO2培养传代，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化贴壁细胞。

1.3 方法

1.3.1 TFV对肝癌HepG-2细胞的毒性作用取对数期的HepG-2细胞，细胞浓度调整至5×104个/ml，取100 μl接种于96孔板，贴壁后24 h同步化，去除培养液。实验设阴性对照组、TFV组(50、100、200、300、400、500、600 mg/L)，空白对照组(不加细胞只加培养液)，每孔200 μl，每组3个复孔。37℃、5% CO2条件下培养24 h，检测前4 h加入MTT (5 mg/ml)15 μl/孔，4 h后吸去培养液，加入DMSO 150 μl/孔，震荡10 min，酶联免疫检测仪于570 nm检查光密度值，计算抑制率。

1.3.2 MTT法测定TFV对肝癌HepG-2细胞增殖的影响取对数期的HepG-2细胞，细胞浓度调整至5×104个/ml，取100 μl接种于96孔板，贴壁后24 h同步化，去除培养液。实验设阴性对照组、阳性对照组(0.3 μmol/L 5-FU)、TFV组(100、150、200 mg/L)和溶媒对照组(0.1%DMSO培养基)，空白对照组(不加细胞只加培养液)，每孔200 μl，每组3个复孔。37℃、5%CO2条件下培养24、48 h，检测前方法同上。

1.3.3 细胞形态学观察参照1.3.2法设置阴性对照组、阳性对照组、TFV组(100、150、200 mg/L)。培养48 h时分别于倒置显微镜下观察细胞形态。

1.3.4 流式细胞术检测TFV对肝癌HepG-2细胞周期及细胞凋亡的影响参照1.3.2法设置阴性对照组、阳性对照组、TFV组(100、150、200 mg/L)、空白对照组。培养24 h后，将悬浮和贴壁细胞收集于1.5 ml EP管中，4℃的70% 冰乙醇固定24 h后，经PI染色，EPICS-XL型流式细胞仪进行细胞周期分析。Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡情况。

1.3.5 Western 印迹方法检测NF-κB p65和IκB-α蛋白的表达参照1.3.2法设置阴性对照组、阳性对照组、TFV组(100、150、200 mg/L)和空白对照组。细胞培养24 h后终止培养，常规方法提取蛋白质，Bradford 法测定总蛋白的量。SDS-PAGE凝胶电泳，并转移至PVDF膜，室温封闭 1 h。5%山羊血清(PBS 稀释)封闭，室温孵育 60 min；加入 1∶300 稀释(1% BSA-PBS 稀释)的 NF-κBp65和IκBα一抗，1∶500 稀释的 β-actin，4℃孵育过夜，加入抗 NF-κBp65和IκBα 二抗(1∶3 000)和β-actin 二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h。行ECL反应，显色。以同一泳道NF-κBp65、 IκBα和 β-actin 条带灰度值比反映蛋白表达水平。

1.4 统计学方法采用SPSS15.0统计软件进行χ2检验及方差分析。

2 结果

2.1 TFV对肝癌HepG-2细胞的毒性作用 TFV对 HepG-2 细胞有明显的细胞毒性作用，药物的浓度-抑制率曲线呈 S形，符合 Logistic曲线。根据生长抑制率采用综合法计算半数抑制量 IC50，MTT 结果显示TFV对 HepG-2 细胞的 IC50值为 229.04 mg/L。

2.2 TFV对HepG-2生长速度及凋亡的影响与阴性对照组比较，TFV组抑制HepG-2细胞的增长明显，并具有浓度依赖性，其中200 mg/L浓度抑制效果尤其明显(P<0.01)，与HepG-2阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。而0.1%DMSO对HepG-2细胞的增长影响较小。与阴性对照组比较，TFV可以促进HepG-2细胞凋亡(P<0.01，P<0.05)，且具有浓度依赖性，其中200 mg/L浓度促进效果明显(P<0.01)，与阳性对照组无差异(P>0.05)。见表1。

2.3 细胞形态学观察阴性对照组和溶媒对照组HepG-2细胞增殖旺盛，排列整齐，细胞饱满，呈现星形或梭形，折光度好；而TFV组和阳性对照组细胞与阴性对照组比较，形态改变明显，细胞间隙增加，细胞排列混乱，细胞体积明显发生改变，胞内颗粒增加，部分细胞脱落，数目减少，细胞碎片增加。其中TFV组伴随浓度变化更加明显。见图1。

2.4 TFV对HepG-2细胞周期的影响经 TFV处理24 h，与阴性对照组相比，G0/G1 期细胞百分数逐渐减少，而 S期的细胞百分数逐渐增加(P<0.05或<0.01),同时 G2/M 期的细胞百分数也逐渐增加(P<0.05)，并具有浓度依赖性，说明TFV 能造成HepG-2细胞S期和G2/M期阻滞。见表2。

表1 TFV对HepG-2生长速度的影响

与阴性对照组比较:1)P<0.01,2)P<0.05;下表同

图1 TFV对HepG-2生长形态的影响(HE，×200)

2.5 TFV对HepG-2细胞NF-κBp65、IκB-α蛋白表达的影响 TFV处理24 h之后,HepG-2细胞中NF-κBp65的蛋白表达量较阴性对照组NF-κBp65蛋白表达量明显下降(P<0.05或P<0.01)，TFV组HepG-2细胞中IκB-α蛋白表达水平较阴性对照组IκB-α蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01)，并呈浓度依赖性，与阳性对照组比较无差异(P>0.05)。见表2、图2。

表2 TFV对HepG-2细胞周期的影响

A：阴性对照组；B：阳性对照组;C、D、E：200、150、100 mg/L TFV组图2 TFV对细胞NF-κBp65、IκB-α蛋白表达的影响

3 讨论

肝癌是常见的恶性肿瘤，发病率和病死率较高，并出现上升趋势。目前手术治疗及放疗、化疗等已取得较大进展，但治疗后高复发和高转移率影响治疗效果。因此，采用天然、安全和高效低毒的天然药物进行抗癌治疗具有重要意义〔3〕。TFV为天然的抗炎抗肿瘤药物，具有抗癌、抗肿瘤、消心脑血管疾病、抗炎镇痛、调节免疫力、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用〔4〕。

本实验提示TFV能显著抑制肝癌HepG-2 细胞的生长，诱导部分细胞凋亡，产生碎片或变小。这与朱利群等〔5〕研究结果一致，显示TFV对癌细胞的增殖抑制及凋亡促进作用。本研究结果表明TFV可能通过某种方式影响了HepG-2 细胞DNA的合成或造成DNA的损伤，最终导致DNA复制不完全，提示可通过阻滞HepG-2细胞的周期并诱导细胞凋亡。

细胞凋亡是一个错综复杂的过程，而诱导肿瘤细胞凋亡在抗肿瘤治疗中具有重要作用。NF-κBp65、IκB-α蛋白表达在细胞凋亡中发挥重要作用，NF-κB为核转录因子，以同源或异源二聚体形式存在，多数为p50和p65组成的二聚体组成参与了肿瘤的发生发展〔6〕，调控细胞的增殖、分化、凋亡以及恶性转化，其活性受到 IκB的抑制，在某些刺激因素刺激下IκB 可发生磷酸化而失活，NF-κB被激活，并进入细胞核结合于特异基因，调控基因进行表达，参与细胞周期和 DNA 复制，上调存活基因或抑制促凋亡因子，保护细胞免于凋亡〔7〕。IκB 是NF-κB强抑制物，已证实NF-κB 的活化对肿瘤细胞抵抗凋亡是必需的〔8〕，而IκB可通过抑制 NF-κB 活性而抑制体外实体瘤细胞的生长，并导致肿瘤发生率明显减低，说明 NF-κB 和 IκB 的表达失衡是肿瘤发生的关键〔9〕。本研究结果提示TFV能通过这增加 IκB的表达、抑制IκB的降解、抑制NF-κB活性来调控HepG-2细胞的增殖，通过对细胞周期和DNA复制的影响，下调编码抗凋亡作用的细胞因子，诱导HepG-2细胞的凋亡。

综上所述，TFV明显抑制人肝癌HepG-2细胞增殖，通过对细胞周期和DNA复制的影响，细胞周期阻滞在S和G2/M期，推测TFV通过影响NF-κB 和 IκB 的表达诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡，具有明显的体外抗肝癌活性。

1 Brustmann H，Naude S.Expression of topoisomerase Ⅱ alpha，Ki-67 proliferating cell nuclear antigen，p53 and argyrophilic nuclear organizer regions in vulvar squamous lesions 〔J〕.Gynecol Oncol， 2002；86(2):192.

2 金伟军,张志东.马鞭草的研究进展〔J〕.时珍国医国药,2007；18(3):693-4.

3 Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics 〔J〕.CA:Cancer J Clin,2011；61(2):69-90.

4 黄锁义,罗建华,刘娇，等.超声波提取马鞭草总黄酮及鉴别〔J〕.时珍国医国药,2007；18(6):1464-5.

5 朱利群,徐珊,罗莉，等.马鞭草有效成分对人绒毛膜癌耐药细胞株JAR/VP16的逆转作用研究〔J〕.南京医科大学学报(自然科学版),2007；27(5):419-23.

6 刘小玉,冯义朝.胃癌及癌前病变中COX-2和NF-κBp65蛋白表达及其相关性研究〔J〕.西部医学,2013；25(2):201-4.

7 Lopez-Guerra M,Colomer D.NF-kappaB as a therapeutic target in chronic lymphocytic leukemia〔J〕.Expert Opin Ther Targets,2010;14(3):275-88.

8 李健,杜芳,齐义军，等.食管癌及癌前病变中NF-κB p65/p50蛋白的表达〔J〕.临床与实验病理学杂志,2006；22(5):560-2.

9 卓佳,陈柏坤,薛向阳，等.核因子-κB p65和IκB-α在宫颈癌中的表达及意义〔J〕.温州医学院学报,2005；35(3):182-4.

〔2015-04-13修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

河南省高等学校青年骨干教师资助计划项目(No.2015GGJS-288)；漯河医学高等专科学校2015年度基础科学研究项目(No.2015-S-LMC03)

1 漯河医学高等专科学校生化教研室