张 丽 郭 丽 曲红玉 李爱歆 高 山

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)



小凹蛋白-1对内皮细胞损伤模型中内皮型一氧化氮合酶及一氧化氮表达的影响及白藜芦醇的作用机制

张 丽 郭 丽 曲红玉 李爱歆 高 山

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的 探讨在人脐静脉内皮细胞损伤模型中小凹蛋白-1的表达情况及对内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和一氧化氮(NO)表达的影响，研究白藜芦醇的作用机制。方法 利用同型半胱氨酸诱导内皮细胞损伤模型，采用siRNA法抑制小凹蛋白-1的表达，采用Western印迹、RT-PCR及化学发光法测定小凹蛋白-1、eNOS和NO的表达情况；同时探讨白藜芦醇对eNOS和NO的表达影响。结果 人脐静脉内皮细胞损伤模型中小凹蛋白-1表达升高，eNOS及NO表达降低；siRNA技术沉默小凹蛋白-1后eNOS及NO表达升高；siRNA技术沉默小凹蛋白-1后白藜芦醇对eNOS及NO的表达无影响。结论 小凹蛋白-1一定程度上对eNOS及NO的表达有抑制作用，白藜芦醇发挥药理作用需要通过小凹蛋白-1介导。

小凹蛋白-1；内皮型一氧化氮合酶；一氧化氮；白藜芦醇

近年来，对于动脉粥样硬化(AS)的发生机制提出了多种学说，如炎症学说和脂质浸润学说等，炎症学说认为AS的发生与多种炎症介质作用有关，如组织因子、细胞间黏附因子等可以促进炎症的发生发展，而内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、Akt及MAPK等具有抗炎作用〔1〕。脂质浸润学说认为AS的发生与细胞内胆固醇的含量及浓度有关。另外也有一些研究表明，炎症因子或介质对细胞内胆固醇的浓度具有一定的调节作用。本实验通过测定小凹蛋白-1(Cav-1)、eNOS及一氧化氮(NO)的表达情况进一步探讨白藜芦醇(Res)的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 脐带、DMEM培养基、胎牛血清，兔抗人Cav-1多克隆抗体、兔抗人内皮型一氧化氮合酶(eNOS)多克隆抗体、TaKaRa RNA PCR试剂盒、硝酸还原酶法试剂盒，Western印迹试剂盒，抗β-肌动蛋白(actin)单克隆、辣根过氧化物酶标记的抗兔和抗鼠抗体，硝酸纤维素膜。细胞培养板，PCR仪，凝胶成像仪。

1.2 细胞培养 无菌操作取佳木斯大学附属第一医院健康孕妇新生儿脐带10～15 cm，磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡，4℃保存，4 h内使用。采用胰蛋白酶灌注法分离脐静脉血管内皮细胞，接种至含25%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，隔日换液除去未贴壁细胞，每3～4 d传代一次，在37℃、5% CO2的培养箱内静置培养。

1.3 试验分组及处理 将生长状态良好的第2代或第3代细胞用于试验。将人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)按2×104个/孔的密度接种于6孔板内，以含10%FBS的DMEM培养液培养，待细胞达到70%～80%的融合度开始试验，试验前采用无血清的培养基进行同步化并过夜。培养细胞分为正常对照组(NC组，用PBS处理细胞)，同型半胱氨酸(Hcy)内皮细胞损伤组(Hcy组)，Cav-1 siRNA的内皮损伤组(siRNA+Hcy组)，Cav-1沉默后不同浓度Res的内皮损伤组(siRNA+Res组)。除NC组外，其余各组均加入1 mmol/L浓度的Hcy进行内皮损伤模型的构建，细胞培养24 h。

1.4 eNOS和Cav-1 mRNA的测定 按照RNA PCR试剂盒说明书进行各组细胞中的总RNA提取与逆转录cDNA。取2 μl的cDNA进行Real-time PCR，反应体系为25 μl。eNOS上游引物5′-ACCCTAGAATGGAGAGCAT-3′，下游引物5′-GCCTGCACTGTCTGTGCCA-3′，Cav-1上游引物5′-CCTCTACAAGCTCAACAACATG-3′，下游引物5′-CACATCTTCAGAGTCAATCTGG-3′，内参β-actin上游引物5′-AGCGACACAGTGCTGGAC-3′，下游引物5′-ACAAGCAATGATCTTGATGAC-3′。

1.5 一氧化氮(NO)浓度的测定 按照硝酸还原酶试剂盒说明书测定不同组别的细胞培养液中的NO浓度。

1.6 eNOS和Cav-1蛋白的测定 根据Western印迹试剂盒的说明，测定各组eNOS和Cav-1的表达水平，并采用Image Lab软件自动分析蛋白条带。

1.7 统计学方法 应用SPSS19.0软件计量资料组间比较用单因素方差分析、q检验。

2 结 果

2.1 Hcy致HUVEC损伤的eNOS，Cav-1，NO表达水平的影响 利用Hcy诱导HUVEC损伤模型后，Hcy损伤组中eNOS及NO表达明显下降，而Cav-1表达明显升高(P<0.01)。见表1。

表1 Hcy致HUVEC损伤的eNOS，Cav-1，NO表达水平的影响±s)

与空白对照组比较：1)P<0.01

2.2 选择性沉默Cav-1后对Cav-1表达的影响 给予siRNA后，Cav-1蛋白表达显著降低。RT-PCR测定Cav-1 mRNA的表达情况，Hcy损伤组Cav-1 mRNA为0.87±0.16，Hcy+siRNA组为0.14±0.13，提示siRNA成功抑制Cav-1表达。Cav-1蛋白表达见图1。

图1 Western印迹检测Cav-1表达

2.3 Cav-1沉默后，Res对NO系统表达的影响 Cav-1沉默后，eNOS表达显著上调。给予不同浓度Res对eNOS的表达未观察到明显变化。见图2，表2。

0：NC组，1：Hcy组，2：siRNA沉默组(10 μmol/L)，3～5：siRNA+Res组(0.1 μmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L)图2 不同浓度Res对eNOS表达的影响

表2 Res对沉默Cav-1表达后的Hcy致HUVEC损伤的eNOS、NO表达水平的影响

与NC组比较：1)P<0.01；与Hcy组比较：2)P<0.01

3 讨 论

AS是心血管疾病发生的最常见病理基础，可以引起冠心病、心绞痛等临床常见疾病。AS发病机制复杂，与多种细胞因子、蛋白分子及信号传到通路有关。具体发病机制目前尚未完全清楚，缺乏有效的预防药物。小凹(caveolae)最早于1955年由日本学家Yamada发现，是一种特殊的囊泡状凹陷结构，能够通过胞饮、胞吐调节细胞内外胆固醇动态平衡〔2〕，小凹家族有多种成员，而其中Cav-1在细胞内的分布最广，作用最明显。Maniatis等〔3〕研究证明，Cav-1的氨基酸序列中有可以与游离胆固醇结合的疏水区域，当细胞内胆固醇浓度升高时，Cav-1可与游离胆固醇结合并将其运输到细胞外，再由高密度脂蛋白(HDL)逆转运到肝脏，最终在肝脏内代谢。因此，Cav-1与AS的病理改变密切相关。在本研究显示，Hcy致HUVEC损伤后Cav-1的表达明显增高，考虑为HUVEC损伤后细胞内脂质代谢失常，导致游离胆固醇浓度升高，从而引起Cav-1升高。

eNOS是一氧化氮合酶中的一种表达类型，能够在内皮细胞中大量表达，NO可由eNOS氧化还原机体内氨基酸而形成。正常生理状况下eNOS及NO在细胞内呈高表达状态，当细胞处于病理状况下时，eNOS的活性降低，NO的产生及释放减少，呈低表达状态。蒋承建等〔4〕通过Hcy损伤大鼠内皮细胞后eNOS及NO的表达均降低，本实验中运用Hcy损伤HUVEC后eNOS及NO表达也明显降低，与以往研究结果一致，说明eNOS及NO可以延缓AS的发生发展。

siRNA技术是RNA干扰技术中的一种，主要通过进入宿主细胞形成RNA诱导沉默复合物，进而与目的基因特异性结合，使宿主mRNA降解而最终蛋白无法表达，达到基因沉默效果〔5〕。本实验说明siRNA沉默Cav-1技术成功，而eNOS及NO的表达升高，说明Cav-1对eNOS及NO的表达具有抑制作用。前期研究表明〔6〕，在Hcy致HUVEC损伤的模型中，Res可以明显升高eNOS及NO的表达，本实验中，沉默Cav-1后给予Res，eNOS及NO的表达无明显变化，且随着Res浓度改变，eNOS及NO的表达仍无明显差异，说明在沉默Cav-1后，Res对eNOS及NO的表达无调节作用。

1 Doi H，Kugiyama K，Oka H，etal.Remnant lipo-proteins induce proatherothrombogenic molecules in endothelial cells through a redox-sensitive mechanism〔J〕.Circulation，2000；102(6)：670-6.

2 Li XA，Everson WV，Smart EJ. Caveolae，lipid rafts，and vascular disease〔J〕.Trends Cardiovasc Med，2005；15(3)：92-6.

3 Maniatis NA，Brovkovych V，Allen SE，et al.Novel mechanism of endothelial nitric oxide synthase activation mediated by caveolae internalization in endothelial cells〔J〕.Circ Res，2006；99(8)：870-7.

4 蒋承建，郭航远，唐伟良，等.同型半胱氨酸对内皮祖细胞生成eNOS、p-eNOSs和NO的影响及黄酒的改善作用〔J〕.中国动脉硬化杂志，2015；23(5)：475-9.

5 张 丽，李 林，李爱歆，等.白藜芦醇对同型半胱氨酸损伤的人脐静脉内皮细胞NO、eNOS和小凹蛋白表达影响〔J〕.中国实验诊断学，2014；18(12)：1923-5.

6 Gary DJ,Puri N,Won YY.Polymer-based siRNA delivery：perspectives on the fundamental and phenomenological distinctions from polymer-based DNA delivery〔J〕.Control Release，2007；121(1-2)：64-73.

〔2016-01-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

黑龙江省自然科学基金面上项目(No.D201210)

高 山(1964-)，男，硕士，主任医师，主要从事循环系统疾病研究。

张 丽(1973-)，女，硕士生导师，副主任医师，主要从事循环系统疾病研究。

R541.4

A

1005-9202(2016)19-4691-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.008