向 导

（湖南省湘西自治州动物疫病预防控制中心，湖南吉首 416000）

家畜布鲁氏菌病的实验室检查方法

向 导

（湖南省湘西自治州动物疫病预防控制中心，湖南吉首 416000）

近年来，布鲁氏菌病的发生形势严峻，为了掌握湘西州现阶段布鲁氏菌病疫源和疫病流行规律，及时发现疫情隐患，有针对性地开展布鲁氏菌病预防控制工作。对辖区内牛、羊开展抽样检测。本次试验对湘西州的681份样品进行检测。首先，用虎红平板凝集试验进行初筛，检出可疑样品再用试管凝集试验检测。

布鲁氏菌病 虎红平板凝集试验 试管凝集试验

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人、畜共患传染病。在家畜中，牛、羊、猪最常发生，且可由牛、羊、猪传染人和其他家畜。其特征是生殖器官和胎膜发炎，引起流产、不育和各种组织的局部病灶。本病广泛分布于世界各地，我国目前在人、畜间仍有发生，给畜牧业和人类的健康带来严重危害。在对布鲁氏菌病诊断中，流行病学资料，流产、胎儿胎衣的病理损害，胎衣滞留以及不育等都有助于布鲁氏菌病的诊断，但确诊只有通过实验室诊断才能得出结果。可分为病原学检测方法和血清学检测方法。其中病原学检测方法分为显微镜检查、病原分离鉴定、分子生物学检测，血清学检测方法分为虎红平板凝集试验、全乳环状试验、试管凝集试验、补体结合试验、ELISA试验。我国目前检测布鲁氏菌病常用的方法是虎红平板凝集试验和试管凝集试验，本次试验用的是以上两种方法对湘西州681份样品进行了检测。现将试验结果分析如下：

1 材料与方法

1.1 材料

待检样品采集于湘西州各县市的规模养殖场的5月龄以上的羊和8月龄以上的牛样品，其中牛样品291份，羊样品391份，待检样品存放于-20 ℃。

1.2 诊断试剂

布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原、阳性血清和试管凝集试验抗原、血清由湖南省动物疫病预防控制中心提供，生产厂家是青岛易帮生物，虎红平板凝集试验抗原批号是20120726、阳性血清批号是20120726，试管凝集试验抗原批号是20120726、阳性血清批号是20120504。

1.3 实验方法

1.3.1 准备工作

（1）血样采集和血清的制备：将牛、羊保定好采用颈静脉采血，血样采好后，用记号笔在离心管上标记好编号，一头牛、羊样品一个编号，采好后的血样放置一晚，第二天再离心，析出血清效果好。离心后的血清样品进行检测，检测后需保存的血清样品放入-20℃保存。

（2）做虎红平板凝集试验需准备的有：洁净的玻璃板，在玻璃板上用记号笔画好大概4cm2的方格。

（3）试管凝集试验的准备：稀释液：0.5%石炭酸生理盐水，检验羊血清时用0.5%石炭酸的10%盐溶液。凝集试验管、试管架、温箱、移液器等。

1.3.2 实验室检查方法

（1）虎红平板凝集试验方法：在玻璃板上各格标记受检血清号，然后用移液枪加相应血清0.03ml，再在受检血清旁滴加抗原0.03ml，用吸管或牙签类小棒搅动血清和抗原使之均匀混合。再双手拿起玻璃板稍微来回轻晃数次，在室温下4分钟内观察结果。每次试验还需设阳性对照、阴性对照。在阳性、阴性对照成立的条件下，受检血清在4分钟内呈现肉眼可见不同程度的颗粒状或絮状的凝集现象可判为阳性，完全不凝集呈均匀粉红色的判为阴性。

（2）试管凝集试验方法：本试验按照＜＜动物布鲁氏菌病诊断技术规程GB/T18646——2002＞＞进行，羊和牛的受检血清稀释方法基本一致，差异是第一管加的稀释液和受检血清的量有所不同。现以羊为例，第一只管标记好编号用移液枪加1.15ml；第2～4管加0.5ml稀释液；然后用吸管吸取受检血清0.1ml，加入第一管内，并混合均匀。充分混匀后吸取该管混合液0.25ml弃去；再取0.5ml合液加入第二管混合均匀，再取第二管混合液0.5ml加至第三管混匀，如此倍比稀释至第四管，从第四管弃去混匀液0.5ml。稀释完毕，从第一至第四管的血清稀释度分别为1：12.5、1：25、1：50、1：100。然后将0.5ml的20倍稀释的抗原加入各管中，并振摇均匀。羊的血清稀释度为1：25、1：50、1：100、1：200；牛的稀释度为1：50、1：100、1：200、1：400。置37-40℃度温箱24小时，再取出检查并记录结果。每次试验应做比浊管和阳性、阴性、抗原对照。

阳性、阴性对照稀释和加抗原的方法与受检血清相同，做抗原对照的目的是观察抗原是否有自凝现象。每次试验需配比浊管，作为判定凝集反应程度的依据。

（3）结果判定：如果试管底部出现点状或圆盘状沉淀，则不需要比较清亮度，如果试管底部出现倒伞状沉淀，则需要比浊管比较液体清亮度。牛1：100血清稀释，羊1：50血清稀释出现“++”以上凝集现象时，受检血清判定为阳性。牛1：50血清稀释，羊1：25血清稀释出现“++”以上凝集现象时，受检血清判定为可疑反应。

2 实验结果

通过用虎红平板凝集试验对681份牛羊血清样品进行检测 ，其中羊血清样品中检测出13份出现凝集现象，用试管凝集试验检测出8份阳性。

表1 虎红平板凝集试验检验结果（单位：份）

表2 试管凝集试验检测结果（单位：份）

3 讨论分析

布鲁氏菌病来势凶猛，并呈扩大蔓延的趋势，有必要进行布鲁氏菌病的长期监测。布鲁氏菌病的分离受实验室条件的限制，很难开展分离工作。因此，对血清抗体的检测是一种简便易行具有良好的敏感性和特异性的方法。从实验结果发现，虎红平板凝集试验（RBPT）检测羊布鲁氏菌病，681头共检测出阳性13份，而用试管凝集试验（SAT）则检测出阳性8份，从试验结果可以看出RBPT检测血清样品存在假阳性。RBPT敏感性高，特异性低，说明RBPT可用于样品的初步检疫的筛选，因RBPT方法简便易行，成本低廉所以检测该方法适用于布鲁氏菌病的大面积检疫和流行病学的调查。

SAT是我国检测布鲁氏菌病诊断的法定方法。是一种比较经典的布鲁氏菌病的检测方法，它可以定性，也可以定量。因而在判定反应强度上比RBPT更精确。SAT检测Igm敏感性较高，可作为布鲁氏菌病的早期诊断，同时可用于人畜布鲁氏菌菌苗免疫后的机体最早期血清学抗体的检测，此法优点是判定容易，具有较高的诊断价值。但不能区分人工免疫和自然感染，而且部分感染的动物抗体滴度达不到检测水平，因而造成漏诊和误诊。

RBPT在使用的时候操作方便，快捷，适用于大规模的筛选检疫，但易出现假阳性。SAT特异性高，比较准确，但操作费时、费力，不适用于大规模的检疫。在实际操作过程中，采用这两种方法，互补优劣。先用RBPT筛选，阳性样品再用SAT检测做出比较准确的判断。通过上述两种方法，检测出阳性畜。说明湘西某养羊场确实存在布鲁氏菌病的感染，进一步做好检疫、淘汰、净化。近年又出现ELISA这种新的检测方法，本试验较传统的SAT试验敏感性要高许多。这将可能作为标准化检测方法进一步推广。

［1］冯元璋.血清学技术在布病诊断上的应用研究现状及评价［J］.仲恺农业技术学院学报，1997，10（1）：79-87.

［2］吕燕，顾春燕.平板凝集反应和试管凝集反应相结合检测布鲁氏杆菌病［J］.内蒙古畜牧科学，2002，（4）：29.

［3］徐百万.动物疫病监测技术手册［M］.北京：中国农业出版社，2010.

［4］朱作锋.2004动物防疫新技术标准规程与管理法规手册［M］.北京：光明日报出版社，2004.