方欢乐，张飒乐，马怀芬，邓文丹，韩宁娟，杨永华



PNU282987对异丙肾上腺素所致小鼠心脏重塑的保护作用

方欢乐1，张飒乐1，马怀芬1，邓文丹1，韩宁娟1，杨永华2*

目的 通过建立异丙肾上腺素所致小鼠心脏重塑模型，观察PNU282987保护心脏的作用。方法 连续7 d皮下注射异丙肾上腺素(ISO)，诱导小鼠心脏重塑模型，同时腹腔给予PNU282987，检测小鼠心脏重量指数、血清乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的活性，观察心肌病理形态学的改变；检测心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量，通过Western blot测定诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达。结果 与正常对照组相比，异丙肾上腺素组心脏重量指数增加，血清LDH和CK水平显著升高，心肌SOD活性下降，MDA含量增加，心肌组织中iNOS蛋白表达增加；与模型组比较，PNU282987可显著降低心脏重量指数、血清LDH和CK水平，增加心肌SOD活性，降低心肌MDA含量，下调iNOS表达。结论 PNU282987可能通过清除氧自由基，降低iNOS的表达，保护异丙肾上腺素导致的小鼠心脏重塑。

PNU282987；异丙肾上腺素；心脏重塑；抗氧化；iNOS

0 引言

心脏重塑是多种心血管系统疾病(如高血压、冠心病、心脏瓣膜病、先天性心脏病、心肌炎症等)的常见并发症和病理基础[1]。尽管早期重塑是一种代偿反应，但持续存在就会逐渐发展为失代偿，导致严重的心律失常、心力衰竭[2]。因此，防治心脏重塑的研究具有重要的临床意义。

研究证实，心室重塑的发生与氧化应激损伤密切相关[3-4]。氧化应激的发生使得体内氧化与抗氧化作用失去平衡，产生了大量氧化中间产物，直接影响心脏细胞结构和功能的损伤[5]。目前，抗氧化应激改善心脏功能有其临床意义。一氧化氮(NO)是体内一种重要的生理功能调节物质，是由一氧化氮合酶(NOS)催化产生。NOS有2种类型，原生型一氧化氮合酶(eNOS)在低水平调控NO，参与体内多种生理功能调节；诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在各种致病因素诱导下，催化高水平NO的产生，参与多种疾病的病理过程[6]，在多种原因的心脏损伤过程中起重要作用[7]。所以抑制iNOS可以减轻心肌的病理改变，保护心脏。

近年研究发现，提高迷走神经张力对心脏具有保护作用，其释放递质ACh是心脏重塑的重要调节因子[8]。PNU282987是特异性的α7nAChR激动剂，研究主要集中在兴奋胆碱能抗炎通路中。但PNU282987是否可以通过抗氧化应激、调节iNOS蛋白活性改善异丙肾上腺素诱导的心脏重塑未见报道。本文旨在观察PNU282987对异丙肾上腺素所致小鼠心脏重塑损伤的影响，为药物的研发提供依据。

1 材料

1.1 动物 昆明种雄性小鼠，体重(25±2)g，清洁级，购于西安交通大学动物中心，动物的质量合格证号：SCXK(陕)2010-001。

1.2 药品和试剂 PNU282987、异丙肾上腺素(美国Sigma公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；多克隆第一抗体iNOS购自abcm公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器 iMark全自动酶标仪(美国Bio-Red公司)；CKX4荧光倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；DYY-2稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)；UVmini-1240紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；JA10003B大量程电子精密天平(上海精密仪器公司)。

2 方法

2.1 异丙肾上腺素致小鼠心室重塑模型 采用异丙肾上腺素皮下注射，建立心室重塑的小鼠模型，给药剂量：30 mg/(kg·d)，连续给药7 d。

2.2 分组及给药 小鼠30只，随机分为3组，每组10只。①对照组：小鼠每天给生理盐水，连续7 d；②异丙肾上腺素模型组(ISO组)：ISO 30 mg/(kg·d)溶解在生理盐水中，小鼠皮下注射ISO，连续7 d；③PNU282987药物组(PNU282987组)：小鼠腹腔注射PNU 3 mg/(kg·d)，30 min后皮下注射ISO，连续给药10 d。

2.3 小鼠心脏标本形态学检测 取左室近心尖一半处心肌组织(先用15%甲醛溶液固定组织，再经过石蜡包埋、切片)进行HE染色。观察心肌组织病理学改变。

2.4 小鼠血清LDH、CK活性测定 小鼠经过眼球取血，收集血液1 mL，放置离心机中，3 600 r/min离心10 min，分离血清，按厂家提供的试剂盒使用说明，测定LDH、CK的活性。

2.5 小鼠心肌SOD活性和MDA含量测定 取出心脏，切约80 mg，把心肌组织放入盛PBS溶液的烧杯中，在冰下将其制备成5%的匀浆液，放置于离心机中，3 600 r/min离心15 min，取上清液，采用黄嘌呤氧化酶法在550 nm测定SOD含量，用硫代巴比妥酸法在532 nm处测定MDA含量。

2.6 Western blot分析检测iNOS表达 取各组心脏组织加入RIPA(碧云天，中国江苏)裂解液裂解，然后用离心机4 ℃离心12 000 r/min。上清蛋白浓度用BCA蛋白测定试剂盒(碧云天)检测。等量蛋白用品(20 μg)用8%SDS-多聚酰胺凝胶电泳，并转移至聚偏乙烯二氟化物膜上(PVDF；Millipore，Billerica，MA)。膜用5%、8%脱脂牛奶或3% BSA TBST(25 mM Tris-HCl，150 mM NaCl+0.2% Tween-20)溶液室温封闭1～3 h后，加入特异性抗体室温孵育1～2 h，4 ℃过夜。抗体一抗浓度均为1∶1 000。在辣根过氧化物酶(HRP)结合二抗(抗小鼠1∶5 000)室温孵育30～40 min前后，膜用TBST洗涤5次。条带用增强化学发光(ECL)试剂(Millipore)发光获得，并用Gel-Pro Analyzer 4.0 software(Media Cybernetics，Bethesda，MD)分析。

3 实验结果

3.1 PNU282987对异丙肾上腺素诱导的心脏重塑小鼠心脏质量指数的影响 小鼠连续皮下注射异丙肾上腺素7 d后，与对照组相比，ISO组心脏质量指数升高；给予PNU282987可抑制小鼠心脏质量指数的增加，与ISO组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，表明PNU282987可抑制异丙肾上腺素引起的心室重塑，见表1。

表1 三组小鼠心脏质量指数比较

注：与ISO组比较，**P<0.01

3.2 PNU282987对异丙肾上腺素诱导的心脏重塑小鼠心肌组织形态学的影响 心肌HE染色显示，正常组心肌细胞排列致密，间质细胞无增生；模型组心肌细胞肥厚改变，心肌细胞体积增大，呈圆形或类圆形；PNU282987组细胞排列较整齐，间质未见明显增生，显示心肌损害的情况较模型组减轻。见图1。

3.3 PNU282987对异丙肾上腺素诱导心脏重塑小鼠血清CK、LDH的影响 由表2所示，ISO组血清CK、LDH高于对照组、PNU282987组，差异有统计学意义。表明PNU282987能显著降低小鼠血清CK 的含量，抑制LDH的含量。

3.4 PNU282987对异丙肾上腺素诱导心室重塑小鼠心肌中SOD、MDA含量的影响 与对照组比较，ISO组小鼠心脏组织中SOD含量下降(P<0.05)、MDA含量明显增加(P<0.05)；而PNU282987组较ISO组小鼠心肌组织中的SOD含量升高、MDA含量降低，与ISO组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

组别只数CKLDH对照组10742.22±104.39**655.00±151.99*ISO组10888.81±79.37794.45±93.89PNU282987组10694.88±137.09**639.00±186.73*

注：与ISO组比较，*P<0.05，**P<0.01

表3 三组小鼠心肌组织中SOD、MDA比较

注：与ISO组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.5 PNU282987对异丙肾上腺素诱导心室重塑小鼠心肌组织中iNOS的表达 用Western blot法检测小鼠心肌组织中iNOS的表达，结果显示，ISO组iNOS的表达显著增加，而PNU282987组iNOS含量的表达明显低于ISO组，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明，PNU282987可以有效抑制异丙肾上腺素所导致的心肌组织中iNOS的表达。见图2。

4 结论

心脏重塑是多种心血管疾病发展的一个重要阶段[9-11]。ISO为β受体激动剂，其对心肌的作用可使心率加快、心肌收缩力增强、心肌细胞肥大、胶原纤维增生，形成心室重塑[12]。本研究显示，异丙肾上腺素连续皮下注射7 d后，小鼠心脏质量指数增加，心肌细胞体积增大，血液中CK和LDH升高。PNU282987可抑制ISO导致的小鼠心脏质量指数和心肌细胞体积的增加，降低血液中CK、LDH，保护损伤的心脏。

图2 PNU对心肌组织中iNOS蛋白表达

在以往对异丙肾上腺素诱导的心室重构模型研究中，发现氧化应激部分参与了异丙肾上腺素诱导的心室重构的发生和发展[13]。心肌的损伤导致氧化应激发生，使得机体内ROS产生过多或发生代谢障碍，超过了体内抗氧化防御系统作用，诱发脂质过氧化，使得脂质过氧化的主要终产物MDA增加，而心肌组织内重要的抗氧化物酶SOD活性降低。测定SOD活性和MDA含量可间接反映氧化应激的程度[14]。本研究显示，ISO诱导的心脏重塑模型中，MDA含量明显增加，SOD含量降低。用PNU282987治疗后，心肌中SOD活性增加，MDA含量降低。表明PNU282987用药后可改善心肌中氧自由基水平及脂质过氧化反应，具有抗氧化的生物学效应。

研究发现，iNOS在细胞受到刺激而被激活后，可以持续合成高水平的NO，参与多种病理生理过程，减弱心肌收缩力而损伤心脏[15]。本研究结果表明，ISO所致小鼠心脏重塑模型中iNOS活性显著增强，而PNU282987可以降低iNOS的表达。表明PNU282987对于ISO诱导的小鼠心脏重塑的抑制作用可能与下调iNOS表达相关，而其具体的分子机制还需要进一步探讨。

综上所述，异丙肾上腺素诱导的心室重塑破坏了氧自由基水平的平衡，提高了iNOS的活性。而PNU282987可以提高SOD含量，降低MDA含量，下调iNOS的表达，抑制氧化应激反应，保护异丙肾上腺素诱导的心脏重塑。

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Protective effect of PNU282987 on isoproterenol-induced cardiac remodeling in mice

FANG Huan-le1,ZHANG Sa-le1,MA Huai-fen1,DENG Wen-dan1,HAN Ning-juan1,YANG Yong-hua2*(1.Xi′an Peihua University,Xi′an 710025,China;2.the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University,Xi′an 712000,China)

Objective To establish the mice cardiac remodeling model in mice and observe the protective effect of PNU282987.Methods Cardic remodeling model of mice was induced by subcutaneous injection of isoproterenol for 7 d,then the mices were intraperitoneally injected PNU282987.The heart weight index,serum lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) activity were measured and the myocardical tissue morphology changes were observed.The content of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in myocardial tissue was measured,and the expression of induced nitric oxide synthase (iNOS) was detected by using Western blot method.Results Compared with control group,the heart weight index,levels of serum LDH and CK,the content of MDA and the iNOS protein expression in myocardial tissue in ISO group were increased,and the activity of SOD was reduced.Compared with model group,PNU282987 could significantly decrease the cardiac weight index,serum LDH and CK levels and the content of myocardial MDA,and increase myocardial SOD activity,while the expression of iNOS was down-regulated.Conclusion PNU282987 can down-regulate the expression of iNOS by clearing the oxidative stress,and protect the cardiac remodeling induced by isoprenaline in mice.

PNU282987;Isoproterenol;Cardiac remodeling;Antioxidant;iNOS

2016-03-18

1.西安培华学院，西安 710025；2.西安交通大学第一附属医院，西安 712000

西安培华学院校级重点科研资助项目(PHKT2015-0704)

10.14053/j.cnki.ppcr.201610004

*通信作者