王海荣　刘伟　安淼　董晓民　余贤美

摘要：对山东省果树研究所试验基地‘玉妃、‘超红、‘岱妃三个桃品种的苹果褪绿叶斑病毒病的发生情况进行调查，采集22份样品，利用ACLSV特异性引物进行RT-PCR检测。结果表明，在‘玉妃桃的叶片中扩增出与苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）预期大小一致的目的片段，并与Gen-Bank登录的病毒核苷酸序列具有较高的一致性，而在‘超红和‘岱妃桃中均未检测到该病毒。

关键词：桃；苹果褪绿叶斑病毒；病原检测

中图分类号：S436.621.1⁺9 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）04-0109-03

桃（Prunus persica L.）为蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus）桃亚属（Amygdalus）多年生中型乔木，在我国有着悠久的栽培历史。近年来，桃树栽培面积不断扩大，以及栽培中苗木引种和调运、无性繁殖代数增多等因素，加快了桃病毒病的传播和发生，极大地影响了桃树的经济价值。苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leafspot virus，ACLSV）属于潜隐性病毒，寄主范围和分布较广，能侵染多种果树，在世界各国均有发生。桃感染该病后，叶片上出现深绿光点或波浪状斑，该症状称为桃深绿光点斑驳，在温室比大田更为明显。某些品种感病后会引起不亲和现象，如果用李作砧木，在6～8年后出现亲和力不强现象，嫁接口坏死树体衰弱。本研究中笔者对‘玉妃、‘超红、‘岱妃三个桃新品种进行苹果褪绿叶斑病毒检测，为下一步建立无毒桃繁殖体系和培育桃优良品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料 供试3个桃品种（‘玉妃、‘超红、‘岱妃）于2014年9月取自山东省果树研究所桃试验基地（泰安）。每棵树采集10个枝条作为一个样品，随机采集有疑似病毒病和无发病症状的幼嫩部位枝条，装入塑料袋，编号标记后立即放人冰盒，带回实验室取叶片作为待测物。其中，‘玉妃桃采集10棵树，编号分别为YF1～YF10；‘超红桃采集10棵树，编号分别为CH1～CH10；‘岱妃桃采集2棵树，编号分别为DF1、DF2。

1.1.2 主要试剂 TRNzol Reagemt，购自北京天根生化科技有限公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，购自Axygen试剂公司。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取 参考用TRIzol法提取桃叶片总RNA，得到的RNA溶液保存于-80℃冰箱中备用。

1.2.2 引物设计 用于检测苹果褪绿叶斑病毒的引物序列为ACLSV-F（5-TCTGCAAGAGAATTTCAGTT-3）和ACLSV-R（5-GTCTACAG-GCTATTTATTATAAG-3）。

1.2.3 RT-PCR 反转录：在1.5mL离心管中加入RNA模板1μL，2.5mmol/LdNTPs2μL，5×M-MLVbuffer2μL，20μmol/L6-Rad0.5μL，20μmol/LOligo（dT）0.5μL，40U/μLRNaseinhibitor0.5μL，200U/μLM-MLV反转录酶0.5μL，加ddH₂O至总体积为10μL。25℃放置10min，42℃放置1h，冰浴2min，-20℃保存备用。

PCR扩增：PCR体系为2×TaqPCRMaster-mix7.5μL，20μmol/LR-primer和20μmol/LF-primer各0.5μL，反转录产物1μL，加ddH₂O至总体积为15μL，充分混匀后置于PCR仪中。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min。

1.2.4 PCR产物克隆及序列分析 PCR产物的纯化、连接、转化和克隆筛选：按试剂盒操作指南，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行扩增产物的纯化，分别将纯化产物连接至pGEM-T克隆载体，转化大肠感菌DH5α感受态细胞，筛选单菌落置于1mLLB培养基（含氨苄青霉素）中培养，通过菌液PCR检测来鉴定重组质粒。

目的片段的序列测定和分析：经菌液PCR，筛选3个阳性菌液送至苏州金唯智生物科技有限公司进行序列测定。通过BLAST数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索目的片段的同源序列，并用DNAMAN软件对苹果褪绿叶斑病毒的基因片段序列进行分析。

2 结果与分析

以不同品种桃叶片的总RNA反转录产物为模板，分别进行RT-PCR扩增，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带，经凝胶回收试剂盒回收纯化后连接至pGEM-T，克隆测序。结果（图1）显示，从‘玉妃桃样品YF2、YF7、YF10中可扩增得到800bp的特异片段，与预期产物大小相同，与GenBank中已报道的ACLSV分离物的核苷酸序列（登录号NC001409）一致性为96%，检出率为13.64%。

3 结论与讨论

我国有丰富的桃品种资源，种植广泛。病毒病的发生一直是影响我国桃产业健康发展的重要原因之一，进行病毒检测是建立无病毒苗木繁殖的必要条件。本研究对山东省果树研究所桃试验基地（泰安）3个桃品种的苹果褪绿叶斑病毒的发生情况进行调查，经RT-PCR检测发现：从3株‘玉妃桃（YF2、YF7、YF10）中检测到该病毒，检出率为13.64%。

苹果褪绿叶斑病毒在桃树上一直有着较高的发病率。阮小凤等（1998）对陕西省桃主产区病毒病发生情况的调查和检测结果显示，ACLSV的发生较普遍，单独感染率为15.8%，与各种病毒的混合感染都有出现；牛飞庆（2012）从我国12个省的417份桃树样品中检测出ACLSV的带毒率为20%；于云（2013）从我国12个省的505份桃树样品中检测到ACLSV、樱桃绿环斑驳病毒（CGRMV）、李属坏死环斑病毒（PNRSV）、杏假褪绿叶斑病毒（APCLSV），其中ACLSV的感染率最高达71.8%，而且山东省的病毒发生率高达58.3%。总之，不同地区桃树的病毒病发生情况与繁殖用苗带毒与否有很大关系，一旦繁殖材料带毒，就会加快桃树病毒病的传播蔓延，所以使用无病毒繁殖材料和选择抗性强的桃树品种是预防桃病毒病的重要手段。本试验只在‘玉妃桃上检测到ACLSV，表明‘超红和‘岱妃有着相对强的抗病性。由于本试验检测的样品数量有限，还无法确定该病毒在本地区的分布情况，仍需进一步调查研究。