何思蓓，张红萍

(1 邵阳市第二中学，湖南 邵阳 422000；2 邵阳学院化学系 湖南 邵阳 422000)



京尼平显色测定氨基葡萄糖含量的初步研究

何思蓓1，张红萍2

(1 邵阳市第二中学，湖南 邵阳 422000；2 邵阳学院化学系 湖南 邵阳 422000)

利用京尼平与氨基发生显色反应，初步建立了京尼平显色测定氨基葡萄糖含量的方法。研究了反应的测定波长、反应时间、反应温度、反应液酸碱度以及反应产物显色稳定性对测定结果的影响，并与Elson-Mrogan法进行了对比。结果表明：京尼平显色法测定氨基葡萄糖含量的最适波长为590 nm，在80 ℃和pH为8～11的条件下反应2 h，反应产物显色性质稳定。该方法与Elson-Mrogan法无显著差别, 可用于实验室的简便测定。

京尼平；显色；氨基葡萄糖；含量

氨基葡萄糖是葡萄糖的氨基被羟基取代后的产物，又称为葡萄糖胺，是人体关节软骨基质中合成蛋白聚糖所必需的重要成分[1]。目前测定氨基葡萄糖含量的方法主要有比色法[2]、滴定分析法[3]、HPLC法[4]等。在比色法中，Elson-Mrogan法 和Indlo-Hcl法是测定氨基糖的特征显色法，但这些方法操作过程繁琐，对反应体系的酸碱度要求苛刻，反应结果易受温度和时间等因素影响[5]。

京尼平是环烯醚萜类化合物，它可以和伯氨基发生缩合反应呈现蓝色，为此，本文利用京尼平与氨基的显色反应，采用分光光度法测定其特征性光吸收，进行氨基葡萄糖含量分析，为氨基葡萄糖及其衍生物的检测提供新的简便方法。

1 实 验

1.1 材料

盐酸氨基葡萄糖，中国药品生物制品检定所对照品；京尼平标准品，上海融禾医药科技有限公司；所用水为蒸馏水，其它试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 主要仪器

WF2 UV-4802H型紫外可见分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 主要试剂的配制

标准溶液配制：氨基葡萄糖盐酸盐经105 ℃干燥至恒重，精确称取50 mg置于50 mL容量瓶中，加水溶解，定容，用移液管精确量取5 mL溶液于另一50 mL容量瓶中，加水定容，摇匀待用。标准液中氨基葡萄糖的含量为1 mg/mL。

1.3.2 最适测定波长的确定

将500 μL的0.1%京尼平溶液加入到3 mL氨基葡萄糖水溶液(1 mg/mL)中，将反应液于35 ℃下恒温，待反应一段时间后，以相同浓度的氨基葡萄糖溶液为参比，对反应溶液在200～800 nm进行吸收光谱扫描，找出最大特征光吸收值。

1.3.3 反应温度和反应液酸碱度的确定

分别取3 mL 氨基葡萄糖水溶液(1 mg/mL)置于两支试管(试管标号：1、2)中，加入500 μL的1 mg/mL京尼平溶液后，将试管1置于80 ℃水浴中反应2 h，将试管2置于35 ℃水浴中反应48 h，分别测定590 nm 时的A值，以1 mg/mL氨基葡萄糖标准溶液做参比，在200～800 nm对反应液进行吸收光谱扫描。

考查溶液酸碱度的影响时，配制pH 3、pH 5、pH 7和8、pH 10和11、pH 12 的缓冲溶液，再取配制好的氨基葡萄糖溶液3 mL，加入450 μL的1 mg/mL京尼平溶液，置于不同的缓冲体系中反应，反应液于80 ℃条件下反应2 h后测定A 590 nm 吸收值，并以1 mg/mL氨基葡萄糖标准溶液做参比，在200～800 nm对反应液进行吸收光谱扫描。

1.3.4 反应产物的稳定性

取1 mL浓度为1 mg/mL的氨基葡萄糖溶液6份加入相同浓度和体积的京尼平溶液，分别在反应时间为30，60，120，180，240，300 min后测定溶液的吸光度。

1.3.5 氨基葡萄糖标准曲线的绘制

在上述最优条件下，取一定浓度梯度的氨基葡萄糖溶液与京尼平反应，测定反应液的吸光度值，分析数据绘制标准曲线。以氨基葡萄糖溶液浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制曲线并得出线性方程为A=1.86×10-3+5.73C(r=0.998)。结果表明，在0.01～0.07 mg/mL范围内，氨基葡萄糖溶液的浓度与吸光度具有良好的线性关系。

2 结果与讨论

2.1 最适测定波长的确定

将氨基葡萄糖与京尼平溶液恒温一段时间后然后混合，并对待测体系利用紫外可见分光光度计进行紫外光谱扫描，结果发现溶液混合后，体系的吸收光谱在反应过程中发生了变化。检测结果表明，反应前，京尼平水溶液在242 nm处有最大特征光吸收值，盐酸氨基葡萄糖水溶液的最大吸收波长在500 nm处。随着京尼平与氨基葡萄糖混合水溶液在35 ℃条件下开始反应，溶液由无色变为蓝紫色，同时光谱扫描发现在590 nm附近出现一个新的特征光吸收峰，并且随着反应的进行， A590 nm值也随之不断增大，这是因为氨基酸与京尼平反应生成的栀子蓝色素有颜色，使反应液在590 nm处出现最大特征光吸收[6]。

2.2 反应温度和酸碱度的确定

采用两种温度(35 ℃和80 ℃)与两种pH (pH 5.5和pH 8.0) 条件，研究京尼平与氨基葡萄糖的显色反应。实验结果发现，固定其他反应条件，温度对显色反应有显著影响，35 ℃时反应48 h的反应液颜色较浅，而80 ℃时反应2 h的溶液颜色较深(图1)。

图1 温度和pH对氨基葡萄糖与京尼平反应的影响

进一步在80 ℃条件下反应2 h，考察酸碱度对氨基葡萄糖与京尼平反应的影响。 表1结果显示，反应液在pH 为8.0、10.0和11.0时，有较大的A590 nm值，反应基本完成，溶液的颜色较深，为深紫色和紫黄色。在pH 为5.0和7.0时，溶液在594 nm和595 nm处有最大吸收峰并且A590 nm值较小，分别为0.12和0.23，溶液颜色为浅蓝色和蓝紫色，这可能是反应没有进行完全。当反应液在过酸(pH 3.0)或过碱(pH 12.0)条件下进行反应，溶液没有发生颜色变化，这说明强酸和强碱不利于反应的进行。

表1 pH对京尼平与氨基葡萄糖溶液反应的影响

2.3 反应产物的稳定性

图2为京尼平与氨基葡萄糖反应后的放置时间对反应产物吸光度值变化的影响。研究结果表明，京尼平与氨基葡萄糖溶液反应在2 h时基本完成，随着放置时间增加，产物的颜色基本没有变化，产物具有良好的稳定性。

图2 放置时间对产物稳定性的影响

2.4 方法学比较

为进一步对方法学进行验证，采用经典的Elson-Mrogan法[7]和京尼平显色法对氨基葡萄糖样品进行检测，并应用 SPSSv13.0 统计分析软件进行分析，结果表明两种方法对氨基葡萄糖含量的测定结果没有显著性差异 (P>0.05)。

3 结 论

利用京尼平与氨基葡萄糖显色测定氨基葡萄糖含量的最适波长为590 nm，在80 ℃和pH为8～11的条件下反应2 h，氨基葡萄糖浓度在0.01～0.07 mg/mL范围内，反应液的吸光值与氨基葡萄糖溶液的浓度的线性关系良好，该反应显色效果明显并且产物显色稳定。该方法不仅与Elson-Mrogan法对氨基葡萄糖的测量具有较好的一致性，而且操作简便，稳定性好，可用于实验室的简便测量。

[1] 薛继杨,王雅萍,张瑶纾.Cu2+络合物紫外法测定盐酸氨基葡萄糖含量[J].中国医药工业杂志, 2013, 44(4):389-391.

[2] 陈金东,李蔚. 滴定分析法和分光光度法测定保健食品中D-氨基葡萄糖盐酸盐含量的研究[J].中国卫生杂志，2002,12(2):143-144.

[3] 冉兰,张榕,文霞. 比色法测定盐酸氨基葡萄糖片的含量[J]. 华西药学杂志,2001,16(3):217-218.[4] 郑家概,王飞,农云军,等. 氨基葡萄糖盐酸盐含量的HPLC柱前衍生法测定[J].分析测试学报，2009,28(9):1081-1083.

[5] 王维,尤瑜敏,周培根. D-氨基葡萄糖测定方法的比较[J]. 食品研究与开发, 2003,4(2)：84-88.

[6] 孙力军. 桅子蓝色素呈色机理的探讨及二步法工艺的研究[J]. 安徽农业技术师范学院 学报,1994,8(3):1-5.

[7] 陈亚. D-氨基葡萄糖盐酸盐的分光光度法测定[J].化工职业技术教育, 2012(9):59-60.

Determination of Glucosamine Content Via Color Reaction of Geniposide

HESi-bei1,ZHANGHong-ping2

(1 No.2 High School of Shaoyang City, Hunan Shaoyang 422000; 2 Department of Chemistry,Shaoyang University, Hunan Shaoyang 422000, China)

A method for determination of glucosamine content was established via color reaction of geniposide and amino group. The effects of wavelength, reaction time, reaction temperature, acidity or alkalinity of solution, color stability of product and comparison with Elson-Mrogan method were investigated. The results showed that under the wavelength of 590 nm, pH 8～11, temperature of 80 ℃, reaction time of 2 h, the product had good color sability. Compared with Elson-Mrogan method, no significant differences were noted. This analysis method may be useful for simple measurement in lab.

geniposide;color; glucosamine; content

何思蓓(2000-)，女，高中在读。

张红萍(1973-)，女，教授，主要从事有机合成研究。

TS202. 3

A

1001-9677(2016)020-0103-03