付晓平

（广东科贸职业学院，广东广州 510430）

食品动物源沙门菌ESBLs和PMQR耐药基因流行特征分析

付晓平

（广东科贸职业学院，广东广州 510430）

本研究对从猪、鸭和鹅分离的31株沙门菌进行耐药性分析，调查ESBLs基因和PMQR基因在沙门菌的流行分布特征。结果显示，31株沙门菌中只检测到CTX-M型ESBLs，3株携带b1aCTX-M-14，3株携b1aCTX-M-27基因；有13株携带b1aOXA型均为窄谱b1aOXA-1，6株携带b1aTEM型也为窄谱b1aTEM-1b。b1aSHV、b1aPER、b1aVEB、b1aGES等各型β-内酰胺酶基因均未检出。PMQR基因oqxAB和aac（6′）-Ibcr检出率最高分别为39%和26%。4株鸭源和1株猪源沙门菌中都检测到qnrA基因，而qnrD基因仅在一种猪源沙门菌中检出。qnrB、qnrC、qnrS、qepA等基因均未检出。研究发现有19株沙门菌同时携带β-内酰胺酶和PMQR，其中一株鸭源沙门菌同时携带CTX-M-14 ESBLs和CMY-2 AmpC酶；有7株同时携带4-5种β-内酰胺酶和PMQR基因。

超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）PMQR；沙门氏菌

1 材料与方法

1.1 菌株

本实验保存的患病动物或送检动物（包括猪、鸭和鹅）直肠拭子中分离鉴定的31株沙门菌用于调查ESBLs和PMQR的流行分布。质控菌ATCC25922。

1.2 β-内酰胺酶基因和PMQR基因的检测

首先对菌株进行复苏，然后采用水煮法提取细菌的总DNA，备用，参考已发表相关文献设计、合成引物，对所有菌株采用PCR方法扩增基因。阳性PCR产物送北京华大公司测序，将测序结果提呈NCBI进行序列比对，确认基因及确定受试菌株β-内酰胺酶基因的亚型。

2 结果

对31株临床分离沙门菌进行PCR扩增，结果得到与阳性对照一致大小的DNA片段（见图1、2、3、4、5、6和7）。31株临床分离沙门菌中，19株检出携带一种或多种β-内酰胺酶基因和PMQR耐药基因，分别有blaCTX-M-9G（6株）、blaOXA（13株）、blaTEM（6株）、blaCMY-2（1株）、qnrA（5株）、qnrD（1株）、aac（6′）-Ib-cr（8株）和oqxAB（12株）。blaCTX-M型只有2种，分别为3株携带blaCTX-M—14（鸭3株），3株blaCTX-M—27（鸭2株，猪1株）。blaOXA型和blaTEM型基因各只有一种，都是窄谱的blaOXA-1和blaTEM-1b，本次研究中，blaSHV、blaPER、blaVEB、blaGES等各型β-内酰胺酶基因均未检出。PMQR基因中，aac（6′）-Ib-cr和oqxAB检出率最高，猪和鸭中都检出。在4株鸭源和1株猪源沙门菌中都检测到qnrA基因，而qnrD基因仅在一种猪源沙门菌中检出。31株沙门菌都没有检测到qnrB、qnrC、qnrS、qepA等基因（表1）。19株β-内酰胺酶基因和PMQR阳性菌株中，其中一株鸭源的同时携带ESBLs和AmpC酶（blaCTX-M-14和blaCMY-2），而2株blaCTX-M-27阳性菌同时携带blaOXA-1。同时携带两种以上PMQR基因沙门菌有8株。同时携带β-内酰胺酶和PMQR基因的菌株有11株，而且携带的基因呈多样性，其中有7株同时携带4-5种β-内酰胺酶和PMQR基因。

3 讨论

图1 b1aCTX-M-9G基因的PCR电泳图M为DL2000 markers，1～6为样品PCR产物，7为阴性对照，8为阳性对照

图2 b1aTEM基因的PCR电泳图M为DL2000 markers，1～6为样品PCR产物，7为阴性对照，8为阳性对照

图3 b1aOXA基因的PCR电泳图M为DL2000 markers；1～7为样品PCR产物；8为阴性对照；9为阳性对照

图4 qnrA基因的PCR电泳图M为DL2000 markers；1～4为样品PCR产物；5为阴性对照；6为阳性对照

图5 aac（6′）-Ib-cr基因的PCR电泳图M为DL2000 markers，1～6为样品PCR产物，7为阴性对照，8为阳性对照

图6 oqxA基因的PCR电泳图M为DL2000 markers，1～7为样品PCR产物，8为阴性对照，9为阳性对照

图7 oqxB基因的PCR电泳图M为DL2000 markers，1～12为样品PCR产物，8:阴性对照，9:阳性对照

越来越多研究表明（引用其他研究结果），无论是人还是动物分离的革兰氏阴性菌对β-内酰胺类抗生素耐药主要是产生了ESBLs。产ESBLs细菌呈世界流行，各个国家和地区流行特征各不相同。近几年国内外大量研究报道了在食品动物源细菌中检测到ESBLs，食品动物可作为耐药基因储存库，选取更多的ESBLs成员，最终转移给人类，加大了人类和动物间ESBLs相互转移的担忧。

本研究对31株沙门菌调查结果显示，blaCTX-M型ESBLs只有2种，分别blaCTX-M—14和blaCTX-M—27，都是印第安纳血清型，可以看出沙门菌携带ESBLs的数量和种类远不如大肠杆菌的复杂和多。本研究中3株产blaCTX-M-14和2株产blaCTX-M-27沙门菌都是从鸭分离，而猪源沙门菌只检测到1株产blaCTX-M-27沙门菌。2009年本实验室调查食品动物源大肠杆菌的结果，鸭源产blaCTX-M-14大肠杆菌的数量远远超过猪源大肠杆菌。鸭是水禽，与水环境接触密切，而blaCTX-M-14是首次在我国医院分离大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中发现，目前是我国最流行的blaCTX-M型ESBLs。本研究中仅鸭源沙门菌检测到blaCTX-M-14，可以推测blaCTX-M-14在我国动物、人、环境已广泛流行分布，并通过水环境加速其传播。

本研究从一株鸭源印第安纳沙门菌中检测到blaCMY-2，值得注意的是，该菌同时携带blaCTX-M-14。医院病人分离的沙门菌blaCMY-2与其他ESBLs共同存在于一株沙门菌上，组合方式有blaCMY-7+blaSHV-9+blaOXA-30，blaCMY-2-+blaSHV-2+blaTEM-1，blaCMY-2+blaCTX-M-37+blaTEM-63，blaCMY-2+blaTEM-63，目前还鲜有研究报道动物源沙门菌blaCMY-2与ESBLs共同存在于一株菌上。有研究报道，blaCMY-2细菌的出现于食品动物中使用第三代头孢菌素头孢噻呋有关。和ESBLs不同，质粒介导的AmpC酶具有更加广泛的耐药谱，其水解底物范围更广，耐药质粒往往同时携带氨基糖苷类、氟喹诺酮类、氯霉素、四环素等抗菌药耐药基因，造成严重的多重耐药性。在本研究blaCMY-2和blaCTX-M-14共同存在于一株印第安纳沙门菌中，使用其他抗生素也可能筛选出blaCTX-M-14阳性菌并促进其扩散传播，提示在食品动物要慎用动物专用头孢噻呋。

本研究首次在沙门菌中检测到oqxAB基因，31株沙门菌中有12株携带OqxAB基因，检出率为39%。

本研究31株沙门菌中，有11株菌同时携带β-内酰胺酶和PMQR基因的菌株，而且携带的基因呈多样性，其中有7株同时携带4-5种β-内酰胺酶和PMQR基因，blaCTX-M-14和blaCTX-M-27分别和三种PMQR基因（qnrA+aac（6'）-Ib-cr+oqxAB_）共同存在一株菌中，对头孢噻肟和环丙沙星都表现高水平耐药。2005年我国香港报道4株对环丙沙星和头孢噻肟耐药的沙门菌同时携带qnrA和blaCTX-M-14基因，有几个研究都指出ESBLs基因与PMQR基因之间可能存在一定的联系。这些同时检测到PMQR和ESBLs相关基因的菌株不仅对第三代头孢菌素高度耐药，对氟喹诺酮类等抗菌药物的耐药性也明显高于其他菌株，呈现多重耐药。

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