徐 晶张海霞蒲国锋杨 静

（1.哈尔滨市农产品质量安全检验检测中心 黑龙江·哈尔滨 150070）（2.黑龙江省农业科学院大豆所 黑龙江·哈尔滨 150000）

■试验报告■

GPC结合超高效液相色谱-串联质谱法测定韭菜中50种农药残留

徐 晶1张海霞1蒲国锋2杨 静1

（1.哈尔滨市农产品质量安全检验检测中心 黑龙江·哈尔滨 150070）（2.黑龙江省农业科学院大豆所 黑龙江·哈尔滨 150000）

利用GPC结合超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测韭菜中50种农药残留。样品用1%乙酸乙腈震荡提取，经凝胶色谱净化，收集9～21min的流出液，在线浓缩近干并用乙腈∶水（1∶3）溶解定容至2m1，收集于2m1样品瓶中，过0.22μm滤膜，以Waters BEH C18色谱柱分离，采用多反应检测模式进行检测，外标法定量。加标水平为0.05mg/kg和0.1mg/kg时，回收率在65.2%～102.1%之间，相对标准偏差小于20%。农药在线性范围内相关系数均大于0.99。方法具有提取效率高，净化效果好，准确度高、灵敏等优点，适用于韭菜中多农药残留检测。

韭菜；凝胶渗透色谱；超高效液相色谱-串联质谱；农药残留检测

韭菜是最常见的绿叶蔬菜之一，其高水分，低热量，富含维生素、粗纤维及硫化物，不但具有很好的营养价值，还具有一定的药用价值，在我国的栽培区域极广。但由于韭菜在种植过程中违规使用高毒农药、不遵守农药安全间隔期等原因，使韭菜中农药残留问题较大，消费者因为食用残留农药的韭菜引发食物中毒的事件频频发生［1］。

韭菜的基质十分复杂，在其农药残留检测过程中，传统的样品前处理技术不易实现基质成分的有效净化，导致在目标残留化合物的检测分析时产生严重的基质干扰现象，影响测定结果的准确性。陈建航等［2］采用微波加热处理，使酶钝化减少打扰，检测姜、韭菜中的农药残留，但在加热过程中会使热不稳定的农药降解。应兴华［3］等用乙腈提取后，直接用气相色谱检测韭菜中的有机磷农药，提取后不净化，会污染色谱柱及检测器，并且杂质干扰较多，易产生假阳性。徐宜宏［4］等采用QuEchERS方检测了韭菜中的34中农药残留，C18、PSA能去除糖等杂质，但去除色素的效果不好，石墨化碳黑能去除色素，但对具有平面结构的化合物如等农药有吸附。

凝胶渗透色谱能很好的去除基质中潜在的干扰目标化合物分析的油脂、色素、生物碱等大分子化合物，并已经在农药残留中得到了广泛的应用［5］。欧盟标委会技术委员会的农药残留测定标准（TC275）和日本厚生劳动省的农药残留分析都采用了GPC法［6-7］。本方法通过在线凝胶渗透色谱对样品净化，液相色谱-串

徐晶，女，职称：高级农艺师。 Emai1：xj_hrb@126.com联质谱进行分析，检测韭菜中的农药残留。

1 试验部分

1.1 仪器、试剂与样品

供试样品韭菜，购自当地超市。

超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪Waters Acquity UPLC–TQD（美国Waters公司），配有电喷雾离子源；凝胶渗透色谱仪FREE STYLE GPC+EVA（德国Lctech）；Milli-Q高纯水发生器（美国Millipore公司）；往复式震荡器（IKA）；高速离心机（Sigma）；涡旋振荡器（IKA）；氮吹仪（美国Organomation）；电子天平（感量0.01g）；乙腈、乙酸、氯化钠、醋酸钠、无水硫酸镁优级纯（科密欧）；乙腈、甲醇色谱纯（美国Fisher公司）；环己烷、乙酸乙酯色谱纯（科密欧）；供试农药标准品浓度为100ug/mL，购自农业部环境保护科研检测所。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的提取

称取粉碎的样品15g（精确到0.01g）置于50mL离心管中，依次加入15mL1%的乙酸乙睛，1.5g醋酸钠，6g无水硫酸镁，2颗玻璃珠，涡混1～2min，往复式振荡器上震荡30min后，5000r/min离心10min，取2.4mL乙腈层，氮吹至小于1.0mL后用环己烷：乙酸乙酯（1∶1）定容至6mL，供凝胶色谱净化。

1.2.2 凝胶色谱净化

凝胶色谱柱填料为Bio-Beads S-X，玻璃柱（300mm×20mm），体积比为1∶1的乙酸乙酯-环己烷溶液作为流动相，流速为4.5mL/ min，进样量5mL，前弃9min，收集9～21min样品，后弃5min，收集液在线旋蒸近干并用乙腈∶水（1∶3）溶解定容至2mL，收集于2mL样品瓶，过0.22μm滤膜，供液用质联仪分析检测。

1.3 仪器条件

1.3.1 超高效液相色谱条件

色谱柱：WatersACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7μm，2.1x100 mm ）；柱温：35℃；进样体积：5μL；流速：0.3mL/min；流动相1∶A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸溶液，流动相2∶A为甲醇，B为5mmol乙酸铵，洗脱程序（见表1）。

表1 两种不同流动相洗脱程序

1.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离源（ESI）；源温度：110℃；毛细管电压：0.5kV；脱溶剂温度：400℃；脱溶剂气流速（N2）：800L/h；锥孔气速：50L/h。采用MRM多反应检测模式。

2 结果与讨论

2.1 提取方法

王连珠等［8］在蔬菜QuEChERS提取方法中对比了了加缓冲盐和不加缓冲盐两种提取方法对66种有机磷农药的提取效果，结果表明加缓冲盐的提取效果好，尤其是对pH敏感的有机磷类农药的提取效率高。本试验提取过程中在提取液1%的乙酸乙睛中加醋酸钠缓冲盐以保证对pH敏感的农药提取率。试验过程中发现，先加入无水硫酸镁会产生结块，把农药包裹在结块里，不利于农药的提取，应在提取液中先加乙酸钠摇匀后再加无水硫酸镁，防止产生结块。

2.2 GPC方法的优化

韭菜中的硫化物和叶绿素含量高，本试验采用GPC净化的方式去除这些杂质。这50种农药的分子量在141～434之间，差距较大，需要通过试验来优化GPC的收集时间。用环己烷∶乙酸乙酯（1∶1）配浓度为1.5μg/mL标准品，进样体积为5mL，从第6min开始，每两分钟接收一瓶，共接收10瓶，氮吹至干，流动相溶解，超高效液相色谱-串联质谱仪检测。检测结果表明，这50种农药的流出时间主要集中在9～21min，但在9min时收集流出液还有少量色素的残留，收集液呈透明浅黄色，若收集时间在10～21min时，叶绿素能去除干净，但这样小分子量的农药如甲胺磷的回收率会降低。所以本试验选择收集9～21min的流出液，收集液在线旋蒸并用乙腈∶水（1∶3）溶解定容至2mL，收集于进样瓶中。

2.3 液相方法的优化

试验进样0.1μg/mL的混合标准品，对甲醇-5mmol/L乙酸铵、乙腈-0.1%甲酸体系的流动相和不同梯度洗脱程序进行优化。结果表明，不同的农药在这两种流动相体系中的电离情况不同，仪器响应值不同，选出6种在两个体系中电离差异大的农药进行对比，见图1。根据不同农药的具体电离情况及出峰时间把这50种标品分为两组，具体见表2；图2，图3为这两组标品的总离子流图。

图1 6种不同种类相同浓度的标准品在两种流动相体系中的响应值

图2 第一组混合标准品总离子流图

图3 第二组混合标准品总离子流图

2.4 质谱方法的优化

以流动注射方式，对50种农药的单一标准溶液进行母离子全扫描，再对其子离子全扫描，每个化合物选择2对响应值高的特征离子对作为定量及定性离子对进行MRM参数优化，优化的质谱参数（见表2）。

表250 种农药标品多反应监测扫描模式（MRM）的质谱参数

2.5 方法的线性、回收率和精密度

为了消除基质效应对定量结果造成的影响，以不含待测物的空白样品为基质液，配制成基质标准溶液，浓度分别为10、20、50、100、150、200、300、400、500μg/kg，进行方法线性的测定。以待检参数的的面积为（y）为纵坐标，质量浓度（x，mg/L）为横坐标，建立标准曲线，得到线性回归方程。线性范围及相关系数见表3。

表3 50种农药的线性范围、线性方程及相关系数

2.6 方法的回收率、精密度及定量限

在样品中添加50、100μg/kg=2个水平的标品，每个水平重复6次，按照1.2的试验方法进行处理，计算法的回收率和精密度。该法在这两个添加水平上的回收率范围在65.2%～102.1%，方法精密度的范围在0.9%～8.7%之间，具体数值见表4。以S/N=10为定量限，不同农药的定量限范围为0.8～15μg/kg，完全可以满足韭菜中农药残留检测的需要。

表4 方法的添加回收率和精密度（n=6）

3 结论

液质质的MRM多反应监测对于分析复杂基质的抗干扰能力强，但样品前处理不干净，会严重的污染液相色谱柱和质谱检测器，并会增大基质效应，影响检测结果。凝胶渗透系统根据化合物的流出时间不同，能够很好的祛除韭菜中的叶绿素等大分子杂质，降低基质干扰，提高检测的准确度。并且GPC系统能自动的完成净化、浓缩、复溶等过程，减少人力，提高了工作效率。每个化合物性质不同，在不同溶液中的带电能力不同，把待测农药分成两组，用不同的流动相进行分析，提高了方法的检出限。该方法能满足韭菜中农药残留的检测。

［1］王文娇，张涛，等.韭菜农药残留现状及防控技术.山东农药科学，2011，10：82-84.

［2］陈建航，叶瑜霏，等.分散固相萃取-气相色谱-质谱联用法检测葱、韭菜和姜中多种农药残留.质谱学报，2011，6：341-348.

［3］应兴华，徐霞，等.毛细管气相色谱法测定韭菜中13种有机磷农药残留的研究.分析测试学报，2009，10：1185-1188.

［4］徐宜宏，蒋施，等.韭菜中34种农药残留同时检测的气相色谱-串联质谱确证方法.农药，2012，11：825-828.

［5］LIUL B，HASHI Y，QIN Y P.Development of automated online gel permeation chromatographygas chromatograph mass spectrometry for measuring multiresidual pesticides in agricultural products［J］.Journal of Chromatography B，2007，845（1）：61-68.

［6］SCHENZLER C，THEIR H P.European standardization of methods for pesticide residue analysis in foods-current status［J］.Food Additives and Contaminants，2001，1（10）：875-879.

［7］Director Notice of Ministry of Health，Labour and Welfare，Japan. Analytical methods for residual compositional substances of agricultural chemicals，feed additives.andveterinarydrugsinfood［S］.Syoku-AnNo.0124001，2005，FinalamendmentsweremadeonMay26，2006.

［8］王连珠，周昱，陈泳.QuEChERS样品前处理-液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中66种有机磷农药残留量方法评估［J］.色谱2012，30（2）：146-153.

Determination of 50 Pesticide Residues in Leafy Greens by QuEChERS-GPC-UPLC-MS/MS

Xujing Zhanghaixia Puguofeng Yangjing
（Harbin Examing and Inspection Center for Agricultural Products Safety and Quality，Harbin 150070，China）（Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin，150000，China）

This paper describes using the method of GPC combined with ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）to detect 50 kinds of pesticide residues in Chinese chives.The samples were extracted with 1%acid acetonitrile，and purified by gel.And then collect 9～21min the outflow；concentrate the outflow to dry and keep the residue；use acetonitrile∶water（1∶3）to dissolve the residue in a constant volume to 2ml；filter the liquid by 0.22μm membrane into a sample bottle.Separate the sample with the Waters BEH C18 chromatographic column.Then the multiple reaction detection mode was used for the detection，and the external standard method was used for quantification.The recovery rate was between 65.2%～102.1，when the spiked levels are 0.05mg/kg and 0.1mg/kg，with RSD less than 20%.The correlation coefficient of pesticide in the linear range was more than 0.99.The method has the advantages of high extraction efficiency，good purification effect，high accuracy，and high sensitive and so on.It is suitable for the detection of pesticide residues in Chinese chives.

Chinese chives；gel permeation chromatography；ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry；pesticide residue detection

10.16627 /j.cnki.cn22-1215/s.2016.10.018