唐 岚，姜燕清，计燕萍，马列峰，单伟光

(1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014；2.嘉兴学院 医学院，浙江 嘉兴 314001)



大孔树脂纯化秋茄叶总黄酮及其抗氧化活性研究

唐 岚1，姜燕清1，计燕萍2，马列峰1，单伟光1

(1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014；2.嘉兴学院 医学院，浙江 嘉兴 314001)

研究秋茄叶总黄酮的大孔树脂纯化工艺及其抗氧化活性.以总黄酮吸附量和解吸率为指标，考察大孔树脂纯化秋茄叶总黄酮的最佳工艺条件.采用DPPH自由基、还原力体系，检测了秋茄叶总黄酮的体外抗氧化活性.结果表明：HPD722树脂纯化效果最佳，经最佳工艺条件纯化后，提取物中总黄酮质量分数可达77.48%.秋茄叶总黄酮具有良好的清除DPPH自由基活性和还原能力，EC50分别为21.8 μg/mL和1.09 mg/mL.HPD722树脂纯化秋茄叶总黄酮的效果显著，秋茄叶总黄酮具有较强的抗氧化活性.

秋茄叶；总黄酮；大孔吸附树脂；纯化；抗氧化活性

秋茄(Kandeliacandel)为红树林秋茄属植物，生长在海岸潮间带或海湾平坦泥滩上，秋茄根、叶和果和枝均可药用，作为民间药用植物在我国已有很长历史.秋茄主要含有黄酮类、甾醇类、萜类、多糖及鞣质等物质，秋茄已报道具有抗氧化、止血、抑菌、抗肿瘤和降血脂功效[1-5].大孔树脂是一种具有多孔立体结构人工合成的聚合物吸附剂，具有吸附选择性强、脱附再生容易、性能稳定和操作简单等优点[6-8]，被广泛的用于黄酮类、皂苷类和生物碱类等的分离纯化[9-12].秋茄叶中富含黄酮类成分，李宝才[1]使用乙醇萃取秋茄叶，经DA201大孔离子交换树脂分离纯化得总黄酮质量分数为29.3%的秋茄黄酮粉末，并证明其有显著的抗氧化活性.纪丽丽等[3]以AB-8大孔离子交换树脂分离纯化秋茄叶乙醇提取液，得总黄酮质量分数为17.8%的秋茄黄酮粉末，并证明其具有抑菌活性.笔者从秋茄叶中提取黄酮类物质，得率约为7%，为秋茄资源的进一步开发利用，得到更高纯度总黄酮，本实验采用大孔树脂纯化方法从秋茄叶提取物中获得较高纯度的秋茄叶总黄酮，并从清除DPPH自由基和还原力方面考察秋茄叶总黄酮的抗氧化能力.

1 材料和仪器

秋茄叶(采自浙江省温州乐清市西门岛南岙村滨海湿地，由浙江工业大学药学院楚楚副教授鉴定)；芦丁对照品(北京恒元启天化工技术研究院，批号：MUST-13040302，纯度≥98%)；HPD722，HPD417，HPD100，DM130，AB-8，D101，HPD826型号大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH·，阿拉丁)；维生素C、三氯乙酸均购于杭州昊天生物技术有限公司；铁氰化钾(温州市化学用料厂)；三氯化铁(如皋市金陵试剂厂)；紫外-可见分光光度计(RF-540型，日本岛津)；中药材粉碎机(FW500，郑州科丰仪器设备有限公司)；恒温摇床(ZHWY-2102型，上海比朗仪器有限公司)；旋转蒸发仪(R210型，瑞士BUCHI)；恒温水浴锅(H-1012398，上海精宏实验设备有限公司)；低温高速台式离心机(17R型号，赛默飞世尔).

2 方法与结果

2.1 秋茄叶总黄酮的测定

2.1.1 对照品溶液的配制

精密称取芦丁对照品10 mg，用60%乙醇溶解并稀释至50 mL，即得质量浓度为0.2 mg/mL的对照品储备液.

2.1.2 标准曲线的绘制

精密量取芦丁储备液0，0.5，1.5，2.0，2.5 mL于10 mL比色管中，加5% NaNO2溶液0.6 mL，摇匀，加10% Al(NO3)3溶液0.6 mL，摇匀静置6 min，再加入1 mol/L NaOH溶液6 mL，最后用60%乙醇定容至刻度，摇匀，测定500 nm波长处吸光度.以芦丁对照品溶液质量分数为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求得回归方程为A=12.641 1C-0.002 9，r=0.999 9.

2.1.3 供试品溶液的制备及测定方法

取秋茄叶药材粗粉适量，用15倍量体积分数为60%乙醇于80 ℃水浴下回流提取2 次，每次0.5 h，抽滤，合并滤液，减压浓缩至溶液无醇味，加适量蒸馏水溶解稀释，离心，得上清液样品.精密吸取适当体积原样液、经静态和动态吸附后样液于10 mL比色管中，按“标准曲线的绘制”方法操作，经NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色后于测定500 nm波长处吸光度，计算总黄酮质量浓度.

2.2 大孔树脂的预处理

大孔树脂经体积分数95%乙醇浸泡处理后，湿法装柱，继续用体积分数95%乙醇冲洗至V(流出液)∶V(水)=1∶5无白色浑浊为止，然后用蒸馏水洗至无醇味，备用.

2.3 大孔树脂的筛选

2.3.1 不同大孔树脂对秋茄叶总黄酮静态吸附-解吸性能考察

分别取不同型号已预处理好的湿树脂，每份1 mL，置250 mL磨口三角瓶中，加入一定浓度提取液样品80 mL，放置恒温摇床中25 ℃，100 r/min恒温振荡 12 h后将树脂滤出，滤液定容于100 mL量瓶，测定滤液中总黄酮浓度.将吸附平衡的树脂用蒸馏水洗涤后放入锥形瓶中，加入95%乙醇80 mL，25 ℃，100 r/min振荡12 h进行洗脱，然后将树脂滤出，滤液定容于100 mL量瓶，测定洗脱液中总黄酮浓度，计算总黄酮吸附量和解吸率，结果见表1.结果表明：HPD100，HPD722和HPD826对秋茄叶总黄酮的吸附量和解吸率明显优于其他几种树脂，故选择这3种进行动态吸附-解吸的考察，从中筛选出较佳的大孔树脂.

吸附量Q和解吸率R计算公式分别为

(1)

(2)

其中：C1，C2分别为吸附前、后样品溶液中总黄酮的质量浓度，mg/mL；C3为洗脱液中总黄酮的质量浓度，mg/mL；V0为树脂体积，mL；V1为样品液体积，mL；V2为吸附液体积，mL；V3为洗脱液体积，mL.

表1 静态吸附-解吸考察结果

2.3.2 不同大孔树脂对秋茄叶总黄酮动态吸附-解吸附性能考察

取预处理好的大孔树脂装柱(固定径高比1∶6)，加入一定浓度的提取液至流出液中显色反应呈阳性后静置30 min，用蒸馏水洗柱至无色，收集蒸馏水并测体积和吸光度.用80%乙醇进行洗脱至显色反应阴性，收集洗脱液测体积和吸光度，计算吸附量和解吸率.由表2可知：HPD722在动态吸附和解吸方面，明显优于其他两种型号的树脂，故宜选用HPD722型大孔吸附树脂作为秋茄叶总黄酮富集和纯化的载体.

吸附量Q和解吸率R计算公式分别为

(3)

(4)

式中：C上为上样液中黄酮质量浓度； V上为上样液总体积；C残为过柱流出液中黄酮平均质量浓度；V残为过柱流出液总体积；C水洗为蒸馏水洗脱下来的黄酮平均质量浓度；V水洗为洗脱的蒸馏水体积；C醇为乙醇洗脱下来的黄酮平均质量浓度 ；V醇为洗脱的乙醇总体积；V为树脂体积.

表2 动态吸附-解吸考察结果

2.4 HPD722大孔树脂纯化秋茄叶总黄酮工艺的优化

2.4.1 上样质量浓度的确定

取大孔吸附树脂3份分别装入树脂柱，分别加入总黄酮质量浓度为1.5，2.8，5.0 mg/mL样品液，上样流速2 mL/min进行动态吸附.1% FeCl3乙醇溶液显色检查流出液，当显色反应呈阳性时，停止上样，静置1 h后，用水洗至无色，合并收集流出液和水洗液，测总黄酮含量，计算总黄酮吸附量，结果分别为13.16，18.77，22.98 mg/mL.由结果可知：上样质量浓度较高为好，但质量浓度超过5 mg/mL容易堵塞树脂柱，因此确定上样质量浓度约为5 mg/mL.

2.4.2 吸附时间的确定

取大孔吸附树脂五份分别装入树脂柱，按上述所确定的质量浓度上样进行动态吸附，分别放置0，0.5，1.0，1.5，2.0 h后用水洗脱，收集洗脱液，测定，计算总黄酮吸附量，结果见表3.由表3可知：在静置0.5 h后黄酮的吸附量基本不变，这可能是在0～0.5 h内柱子中游离的秋茄叶总黄酮和树脂空隙中的黄酮逐渐被树脂所吸附，使得黄酮的吸附量升高.而黄酮的解吸率在各个时间点都比较高，没有显著性差异，因此选择上样后静置吸附0.5 h.

表3 吸附时间的影响

2.4.3 上样流速的确定

取大孔吸附树脂三份装入树脂柱，加入最佳质量浓度样品液，分别以1，2和3 mL/min的流速进行动态吸附.待显色反应呈阳性时，停止上样，记录上柱量，测定，计算总黄酮吸附量，结果分别为28.54，23.33，22.60 mg/mL.由结果可知：上样流速则是越慢越好，考虑到效率问题，确定上样流速为1 mL/min，即为3 BV/h.

2.4.4 上样量的确定

取大孔吸附树脂装入树脂柱，按上述所确定的吸附条件上样，分段收集流出液，每10 mL收集1份，共收集25份.测定每份收集液的总黄酮质量浓度，确定最佳上样量，绘制泄漏曲线.由图1可以看出：从第14份洗脱液开始，洗脱液中的黄酮质量浓度增大明显，说明此时秋茄叶总黄酮开始明显泄漏.故确定样品液的最大上柱体积为130 mL，即6.5 BV.

图1 上样量泄漏曲线Fig.1 Leak curve of sample volume

2.4.5 洗脱剂体积分数的确定

取大孔吸附树脂五份分别装入树脂柱，按上述所确定的吸附条件上样，进行动态吸附，先水洗后分别用20%，35%，50%，65%，80%，95%体积分数乙醇以2 mL/min的流速洗脱至显色反应阴性，收集洗脱液，测定，计算总黄酮解吸率和固形物中总黄酮质量分数.结果见表4.由表4可知：50%的乙醇洗脱黄酮的解吸率和总黄酮质量分数都较高，因此选择50%乙醇为洗脱剂.

表4 洗脱剂体积分数考察结果

2.4.6 洗脱流速的确定

取大孔吸附树脂3份分别装入树脂柱，按上述所确定的吸附条件上样，进行动态吸附，解吸流速分别为1，2，3 mL/min进行解吸，收集洗脱液，测定，计算总黄酮解吸率.结果不同洗脱流速的总黄酮解吸率分别为95.02%，94.15%，93.92%.由结果可知：洗脱流速越低，解吸率越高，解吸效果越好，因此选择1 mL/min作为洗脱流速，即为3 BV/h.

2.4.7 洗脱剂用量的确定

取大孔吸附树脂装入树脂柱，按上述所确定的吸附条件上样、洗脱，分段收集共5份洗脱液，每份为l个树脂柱体积(1.0 BV)，测定并计算每份洗脱液的总黄酮质量浓度和累积洗脱率.结果见表5.由表5可知：当收集到2倍柱体积的时候，大部分的黄酮已经由大孔树脂中解吸出来；当收集到4倍柱体积的时候，积累解吸率已达到98.61%.说明此时黄酮类化合物已基本洗脱完全，从节约资源和黄酮纯度的角度考虑，选择4倍柱体积.

表5 洗脱剂用量考察结果

2.4.8 最佳工艺验证

取未经处理的HPD722大孔树脂50 g共三份，树脂预处理后，装于径高比分别为1∶6树脂柱内，以3 BV/h流速上样，上样液总黄酮质量浓度为5 mg/mL，上样体积为6.5 BV，放置30 min后，先用蒸馏水冲洗杂质，然后用4 BV 50%乙醇洗脱，以3 BV/h流速洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥得浸膏，计算总黄酮质量分数.结果见表6，三批浸膏粉中，总黄酮平均质量分数为77.48%，RSD为0.62%，表明工艺稳定、可行.

表6 验证试验结果

2.5 秋茄叶总黄酮抗氧化能力研究

2.5.1 秋茄叶总黄酮对DPPH自由基清除活性的测定

DPPH自由基清除活性参考Adeolu[13]等方法.3.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液与不同质量浓度的1.0 mL秋茄叶总黄酮溶液混合均匀，静置室温反应30 min，517 nm处测定吸光度值A1，并与维生素C进行比较.以1.0 mL 60%乙醇代替待测液，得吸光度A2，以3.0 mL 60%乙醇代替DPPH溶液，得吸光度A0.清除率计算公式为

(5)

由图2可知：秋茄叶总黄酮具有良好的清除DPPH·作用，并且随着浓度的增大，清除活性也随之增强，其EC50为21.8 μg/mL，虽然其活性较对照组Vc低(EC50=8.75 μg/mL)，但在50 μg/mL时其活性已达到78.57%.

图2 Vc和秋茄叶总黄酮对DPPH·的清除能力Fig.2 Scavenging activity of Vc and total flavonoids from Kandelia candel against DPPH·

2.5.2 秋茄叶总黄酮总还原能力考察

图3 Vc和秋茄叶总黄酮的相对还原力Fig.3 Reductive activity of Vc and total flavonoids from Kandelia candel leaves

3 结 论

通过静态吸附与解吸、动态吸附与解吸试验，对7种大孔树脂HPD722，HPD417，HPD100，DM130，AB-8，D101，HPD826进行筛选，得出HPD722型树脂对秋茄叶总黄酮有较好的吸附和解吸性能，富集效果好，因此选用HPD722树脂进行纯化工艺研究.最佳纯化工艺为：上样液质量浓度为5 mg/mL，上样流速为3 BV/h，上样体积为6.5 BV，吸附30 min后，先用蒸馏水洗脱除去杂质，然后用4 BV 50%乙醇以3 BV/h流速洗脱.利用HPD722树脂纯化得到总黄酮质量分数为77.48%的产品.且纯化后的秋茄叶总黄酮具有良好的清除DPPH自由基活性和还原能力，EC50分别为

21.8 μg/mL和1.09 mg/mL，表明秋茄叶总黄酮有望成为一种优良的天然抗氧化剂.

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(责任编辑：刘 岩)

Study on purification with macroporous resin and antioxidant activity of flavonids fromKandeliacandelleaves

TANG Lan1, JIANG Yanqing1, JI Yanping2, MA Liefeng1, SHAN Weiguang1

(1.College of Pharmacy, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China;2.Medical College of Jiaxing University, Jiaxing 314001, China)

The purification with macroporous resin and antioxidant activities of flavonoids fromKandeliacandelleaves were studied by the optimal purification technology with taking the adsorption amount and desorption rate as the evaluation index. The antioxidant activities ofKandeliacandelleaves flavonoids was detected by DPPH and reducing power. The result showed that HPD722 resin was the best resin for purification of flavonoids. The purity of total flavonoids has been increased to 77.48% after the purification under optimised conditions. The flavonoids came fromKandeliacandelleaves had strong scavenging DPPH radical(EC50=21.8 μg/mL)and reducing power(EC50=1.09 mg/mL). HPD722 resin is the best resin for the purification of flavonoids and the flavonoids fromKandeliacandelleaves has strong antioxidant activity.

Kandeliacandelleaves；total flavonoids；macroporous resin; purification; antioxidant activity

2016-03-01

浙江省科技厅公益性技术应用研究计划(2012C23028)

唐 岚(1974—)，女，广西玉林人，副教授，研究方向为中药制剂，E-mail tanglan@zjut.edu.cn.

R284.2

A

1006-4303(2016)05-0519-05