钱俊青，赵莉萍，范 菁，潘存丽，俞 明

(1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014；2浙江工业大学 海洋学院 浙江 杭州 310014)



响应面法优化预酶解提取米渣蛋白的研究

钱俊青1，赵莉萍2，范 菁1，潘存丽1，俞 明1

(1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014；2浙江工业大学 海洋学院 浙江 杭州 310014)

为改善米渣中蛋白质的提取效果，采用中性蛋白酶酶解、碱溶两步法提取米蛋白.固定碱提取工艺，通过单因素实验，确定了预酶解的基本条件；并以pH和加酶量和反应时间为自变量，蛋白质提取率和质量分数为响应值，采用Box-Behnken试验设计方法，对预酶解条件进行响应面(RSM)优化，确定了预酶解的最优工艺.最优条件下得到米渣蛋白质的提取率为78.27%，质量分数为72.86%，较直接碱提取，两者均有了一定的提高，且以蛋白质提取率提升幅度大，且优化条件下的实验结果与RSM回归方程预测值吻合良好.

米渣；中性蛋白酶；响应面；提取

稻谷是重要的粮食作物，我国稻谷产量占粮食总产量的40%，居世界首位[1].米渣是工业上生产糖和味精的副产物，其蛋白质质量分数为50%～60%，是大米的5～8倍[2].与稻米蛋白类似，米渣蛋白具有高营养性[3]、低过敏性、风味温和及不会引起肠胃胀气等独特性质，许多国家将其作为婴幼儿的蛋白补充剂[4-5]；与此同时，米渣蛋白还具有降胆固醇、降血压、抗氧化和抗癌变等多种保健功能[6-10]，因此具有极其重要的回收利用价值，而目前我国对米渣的处理主要是用作饲料，其工业附加值低，经济效益差，不利于稻米的深加工.米渣蛋白中80%以上为碱溶性谷蛋白，这些蛋白分子间通过大量的二硫键和疏水基团进行交联、凝聚，使得蛋白溶解性下降.目前，米渣蛋白的提取方法主要为碱法[11-12]和酶法[13-16]，其中酶法生产条件温和，液固比小，蛋白质营养成分保留完全，但大多数酶价格昂贵，且提取时间较长，不利于工业化生产，且直接用酶法得到的样品糖含量一般较高，需进一步纯化，生产成本较高[17]；碱法提取米渣蛋白，是利用碱液的高效溶解性，将米蛋白与淀粉的紧密结构变得疏松，同时破坏蛋白质分子中的氢键，解离极性基团，促进蛋白质分子溶解，提取工艺简单，生产成本低，同时碱提取的稻米蛋白乳化性较好，在工业中应用广泛[18]，但高浓度碱会对蛋白质造成一定的破坏，且高固液比会产生大量污水，不利于绿色经济的发展.

为提高米渣蛋白的提取效果，降低高浓度碱的负面作用，将酶解和碱溶法相结合提取米渣蛋白.采用来源广泛、价格便宜、稳定性好和水解强度大，水解产物风味佳的中性蛋白酶对米渣作预酶解，将结合状态的蛋白质分离，再利用碱法提取米蛋白.着重研究了预酶解pH值、加酶量、温度和反应时间4个因素对蛋白质提取率和质量分数的影响，并对其进行了响应面分析法(RSM)[19-20]优化，并对实验结果进行统计学分析，确定了最佳酶解条件.

1 材料与方法

1.1 材料与设备

米渣：杭州味精厂(水分50.19%；粗蛋白质28.39%)；食用级中性蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司，活力为5. 0×104 u/g；KDY-08C(8Ⅱ)半自动凯式定氮仪；DS-1型高速组织捣碎机；PHS-3C型精密pH计；LD4-2离心机；化学试剂均为分析纯.

1.2 试验方法

1.2.1 米渣蛋白的碱法提取

以蛋白质提取率和质量分数为指标，单因素优化碱法提取米渣蛋白，得到碱提取最优条件为：固液比1∶8，pH=12.0，温度40 ℃，提取时间4 h；此条件下得到蛋白质的提取率和质量分数分别为50.44%和67.32%.

1.2.2 米渣蛋白的复合提取

由于碱法直接提取米渣蛋白，得到的蛋白质提取率和质量分数相对不高，因此考虑碱提取前对米渣进行酶解，并进行酶解工艺优化，基本流程为：米渣→粉碎→60目筛→酶解→碱提取→离心分离→上清液.

1.2.3 蛋白质提取率的计算

总蛋白质的测定参照GB/ 5009.5—2010《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》，提取率=(上清液中蛋白质质量/原料中蛋白质质量)×100%.

1.2.4 预酶解条件的单因素考察

分别称量50 g米渣，粉碎均匀、过筛，加水至固液比为1∶7，置于不同条件下机械搅拌，分别考察酶解pH (6.0～8.0)、加酶量(200～600 u/g)、酶解温度(30～55 ℃)、酶解时间(2～6 h)，对蛋白质提取率和质量分数的影响.

1.2.5 响应面法优化预酶解提取工艺

由单因素试验结果可知，酶解温度对蛋白质提取效果的影响相对不明显，45 ℃条件下，蛋白质提取率和质量分数最高，因此可以固定温度为45 ℃，对与其相关性更密切的其他因素进行优化.采用Box-Behnken试验设计，以加酶量、酶解pH、反应时间3个因素为自变量，分别以A，B，C表示，以蛋白质提取率和质量分数为响应值，设计了3因素3水平的RSM实验，试验方案、条件及结果如表1，2所示.

表1 响应面试验设计

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 酶解pH对蛋白质提取率和质量分数的影响

研究表明[21]：pH对酶的稳定性，酶活性中心上活性基团的解离程度以及底物和辅酶的结合程度有一定的影响.固定酶解固液比1∶7，温度45 ℃，加酶量500 u/g，酶解时间5 h，研究酶解pH对蛋白质提取率和质量分数的影响.由图1(a)可见：当pH为 6.0～7.5时，蛋白质提取率和质量分数增加明显，pH>7.5，蛋白质提取率和质量分数趋于平稳.一方面酶的本质决定了酶的活性部位的基团对体系pH的变化比较敏感，其解离状态随着pH的变化而变化，这些变化直接影响酶的构象，影响酶对底物的催化；另一方面pH的变化也会影响米蛋白的溶解性，碱性下降，蛋白质析出.为充分发挥酶的活力，选择pH为7.0～8.0进行RSM优化.

2.1.2 加酶量对蛋白质提取率和质量分数的影响

固定酶解pH 7.5，其他条件不变，研究加酶量对提取效果的影响.由图1(b)可见：随着加酶量的增加，蛋白质提取率和质量分数同比升高，加酶量超过400 u/g，两者变化趋于平缓.分析原因是当加酶量达到一定程度后，酶与底物的作用达到饱和，更大的酶用量产生的作用较小.

图1 pH和加酶量对提取效果的影响Fig.1 Effect of enzymatic pH and enzyme content on extraction

2.1.3 酶解温度对蛋白质提取率和质量分数的影响

酶的本质为蛋白质，文献表明，酶只有在最适反应温度时，酶活力才最大，温度过高或过低，导致蛋白质变性，酶的活力下降[22].固定加酶量400 u/g，其他条件不变，考察不同温度对蛋白质提取效果的影响.由图2(a)可见：40～50 ℃范围内，蛋白质质量分数和提取率变化不明显，酶解温度45 ℃时，两者相对最高，说明中

性蛋白酶在此反应体系的最适温度为45 ℃左右.

2.1.4 酶解时间对蛋白质提取率和质量分数的影响

酶解温度45 ℃，其他条件不变，考察不同酶解时间对蛋白质提取效果的影响.由图2(b)可见：随着时间的延长，蛋白质质量分数和提取率均明显上升，超过4 h，两者趋于平稳.为提高提取效率，节约成本，选择3～5 h作进一步优化.

图2 温度和时间对提取效果的影响Fig.2 Effect of enzymatic temperature and enzymatic time on extraction

2.2 RSM结果分析

由表2可见：17个实验点，包含5个零点实验和12个析因试验.试验号10～12，16～17为中心实验，其余为析因试验.其中零点为区域的中心点，析因点为各自变量所构成的三维顶点，中心试验重复5次，用以估计试验误差.

运用Design-Expert 8.0对所得数据进行回归分析，米渣蛋白提取率和质量分数的回归方程方差分析如表3，4所示，RSM3D图像见图3,4.各因素经回归拟合后，得到提取率回归方程为：提取率=-322.913+0.318A+74.150B+16.055C-8.500×10-3AB-9.25×10-3AC+0.85BC-2.222×10-4A2-4.69B2-2.023C2；质量分数回归方程为：质量分数= -519.275 + 0.216A+ 124.525B+ 37.348C+ 9.000×10-3AB+4.5×10-3AC-3.250BC-3.408×10-4A2-7.730B2-1.533C2，其中：A为加酶量；B为pH；C为反应时间.

表2 响应面分析及试验结果

从表3可知：整体模型的“Prob>F”<0.05，说明建立的模型显著，能起到较好的预测作用.另外试验中失拟项P=0.288 5>0.05，说明模型无失拟因素存在，实验误差小，用该回归方程代替真实实验对结果进行分析准确可靠.同时，由回归方程各项方差结果可知，所有自变量和提取率线性关系显著，其中A(加酶量)和C(酶解时间)二次项的影响显著，交互作用中，BC(pH与酶解时间)影响显著.以质量分数为指标，由表4可知：“Prob>F”<0.05，P=0.070 2>0.05，无失拟因素存在.在所选条件下，因素A，B，C对质量分数的影响均显著，A和B的二次项的影响显著，交互作用中，表现为P>0.05，说明以蛋白质质量分数为指标，三因素的交互作用不明显.

表3 蛋白提取率回归分析结果

表4 蛋白质量分数的回归分析结果

2.3 最佳提取条件的确定

以蛋白质提取率和质量分数同时达到最高为最佳点，运用Design-Expert软件进行RSM回归分析，得出最佳酶解工艺条件为：加酶量456.18 u/g，pH7.52、酶解时间4.69 h；此条件下，理论预测的提取率79.93%，质量分数75.13%.考虑实际操作的便利性，将酶解条件修正为：加酶量456 u/g，pH 7.5，酶解4.7 h，其他条件不变进行提取，得到提取率78.27%，质量分数72.86%，理论值误差在2%～3%，因此可确定RSA法优化的酶解工艺准确可靠.

图3 提取率的响应面Fig.3 Responsive surfaces of protein extraction rate

图4 质量分数的响应面Fig.4 Responsive surfaces of protein mass fraction

3 结 论

采用中性蛋白酶预酶解、碱溶法提取米渣蛋白，固定碱提取工艺：固液比1∶8，pH 12.0，温度40 ℃，提取时间4 h条件下，预酶解pH值、温度、加酶量、反应时间对蛋白质提取率和质量分数均有影响；单因素实验筛选出预酶解温度为45 ℃；RSM优化预酶解工艺，得出最优酶解条件(加酶量456.18 u/g，pH值7.52、反应时间4.69 h)；根据实际实验操作的可行性，在加酶量456 u/g，pH 7.5，反应时间4.7 h，温度45 ℃条件下进行验证试验，得到米渣中蛋白质的提取率为78.27%，蛋白质量分数为72.86%，与直接碱提取相比，蛋白质提取率提高了55.17%，质量分数提高了8.23%，说明预酶解显著提高了米渣蛋白的提取效果，且响应值的实验值与回归方程预测值吻合良好，有一定的应用价值.

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(责任编辑：刘 岩)

Optimization on pre-enzymolysis extraction technology of rice protein from rice dregs with response surface analysis

QIAN Junqing1, ZHAO Liping2, FAN Jing1, PAN Chunli1, YU Ming1

(1.College of Pharmaceutical Science， Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310014, China ；2.College of Ocean Science， Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310014, China)

To improve the rice residue protein extraction, a method of extracting rice protein from rice dregs by neutral protease-dilute alkali hydrolysis was studied. Fixed alkali extraction technology, through the hydrolysis of single factor experiment, general conditions of enzymatic hydrolysis were obtained. Through Box-Behnken design, enzymolysis pH, amount of neutral protease and enzymolysis time as variables, protein extraction rate and mass fraction as response values, the optimum hydrolysis conditions of enzymes were investigated with response surface method. Under the optimal conditions, the protein yield was 78.27%, protein content was 72.86%. Compared with the results of alkaline extraction, they both have increased, especially for the protein extraction rate. Further more, the results were consistent with the predicted values, implying that the method has certain practical value.

rice dreg; neutral proteinase; response surface method; extraction

2016-03-01

钱俊青(1965—)，男，浙江杭州人，教授，研究方向为生药资源开发与利用，E-mail：qjq@zjut.edu.cn.

TS212

A

1006-4303(2016)05-0505-05