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种植体联合骨组织工程技术修复犬下颌骨节段缺损的实验研究

2016-11-18李东毛豪丽白珊珊袁捷韦敏张文杰刘伟曹谊林

组织工程与重建外科杂志 2016年5期
关键词:下颌骨植入术珊瑚

李东 毛豪丽 白珊珊 袁捷 韦敏 张文杰 刘伟 曹谊林

种植体联合骨组织工程技术修复犬下颌骨节段缺损的实验研究

李东毛豪丽白珊珊袁捷韦敏张文杰刘伟曹谊林

目的观察应用种植体联合骨组织工程技术,修复犬下颌骨节段缺损的效果。方法体外扩增培养、成骨诱导犬BMSCs。将第2代细胞复合珊瑚后修复犬自体右侧下颌骨3 cm的节段缺损,术后32周植入种植体(实验组n=3);同时,以邻近正常骨植入种植体作为对照(n=3)。植入4周、12周、26周后,分别通过影像学、大体形态观察、组织学和生物力学等方法,检测骨缺损的修复效果。结果植入后26周,X线片和CT均显示种植体与实验组及对照组骨质为良好骨性愈合,实验组种植体周围新生骨密度较高。Micro-CT显示,实验组骨密度和对照组间无显著性差别(P>0.05)。大体观察见种植体与组织工程骨和正常骨均形成紧密连接。组织学显示,实验组与对照组均有较多成熟骨结构。生物力学测试结果表明,实验组与正常下颌骨力学强度无显著性差异(P>0.05)。结论自体成骨诱导BMSCs复合珊瑚形成的组织工程化骨,可较好地修复犬下颌骨节段缺损,植入种植体后可进一步促进骨成熟。

种植体下颌骨修复骨髓基质干细胞珊瑚

创伤、感染、肿瘤或先天畸形可导致下颌骨缺损,自体骨移植是目前疗效最佳的治疗手段,但患者需承受自身供区的明显损伤[1-2],且供区来源有限,寻求更好的治疗方法一直是关注的焦点[3-6]。组织工程技术为修复下颌骨缺损提供了新的思路,Schliephake等[7]利用煅烧牛骨支架,复合自体骨髓基质干细胞(Bonemarrow stromal cells,BMSC),修复了羊下颌骨节段缺损,证明了BMSC作为骨组织工程种子细胞的可行性,但煅烧骨降解很慢,不完全符合组织工程支架材料的要求。珊瑚一直是临床广泛应用的骨替代材料,具有良好的骨传导作用,还有较好的降解性能和力学强度[8]。我们的前期实验已证实,成骨诱导的自体BMSC复合珊瑚构建组织工程化骨,可较好地修复犬下颌骨3 cm的节段缺损[9]。

由于下颌骨特殊的解剖位置,在临床以自体骨移植进行骨修复时,还需考虑恢复正常的咬牙合关系,即种植体治疗的介入,后者提供了皮质骨成熟所要的应力环境,且两者互为依托。因此,引入种植体技术对组织工程下颌骨修复的促进作用值得探究。

本研究采用自体BMSCs经体外扩增、诱导分化后与珊瑚复合,修复犬下颌骨3 cm的标准节段缺损,32周后植入种植体,评估其对组织工程下颌骨成熟的影响,并对新生骨组织的生物学特性进行检测,为今后的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

地塞米松、β-磷酸甘油钠和2-磷酸抗坏血酸(美国,Sigma公司);杂交犬(上海农学院);珊瑚(海南三亚产滨珊瑚);固定钛板、钛钉(常州康辉医疗器有限责任公司);种植体(韩国,Implantium公司)。

1.2细胞-材料复合物制备

从比格犬髂骨抽取骨髓,离心,获原代BMSCs,培养纯化至第3代后,以1.5×107cells/cm3的密度接种于珊瑚,体外培养后,移植到体内下颌骨缺损处。

1.3手术方法

3只成年杂交犬,体质量18~25 K g,术前8周拔除右侧上下全部前磨牙及第一磨牙,预防感染。同时,拔除左侧上下全部前磨牙及第一磨牙(图1A),作为生物力学测试的正常下颌骨。5%的戊巴比妥钠(0.5 ml/kg)麻醉,术中静脉滴注青霉素160万单位抗炎。右侧卧位,颌下皮肤切开进入,暴露下颌骨体,置入钛板,近远中各3枚钛钉固定,线锯离断,形成3 cm节段缺损(图1B),去除骨膜,局部骨蜡填塞止血。随后将诱导细胞BMSC-珊瑚复合物置入缺损处,逐层关闭(图1C)。术后隔日起青霉素80万单位肌注(每天2次,3 d),防止感染,流质/半流质饲养。术后22周全部拆除钛板。术后32周重新作口内切口,分别在组织工程骨(实验组)及其邻近正常骨(对照组)处随机植入种植体,然后关闭创面(图1D),术后抗感染治疗同前,进半流质/普食饲养。

图1 手术步骤Fig.1 Operation description

1.4影像学观察

植入术后4周、12周、26周行X线摄片,观察实验组和对照组种植体与骨质愈合情况;植入术后26周,采用GE Lightspeed Ultra 16 CT仪,扫描厚度0.625 mm,摄取犬颅颌面断层影象,并行三维骨结构重建。随后锯下双侧下颌骨标本,采用Micro-CT测定标本局部组织的骨密度,实验组和对照组采用DUNCAN方法进行比较,SAS 6.12行统计学处理。

1.5大体形态结构及组织学检测

植入术后26周,取材观察实验组和对照组大体形态结构。取1只下颌骨标本,4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脱水,以聚甲基丙烯酸甲脂包埋,行包括连接处纵切面的硬组织切片,厚度50μm;随后行苦味酸-品红Van Gieson染色,观察新骨形成和材料降解情况,以及种植体与骨质愈合情况。

1.6生物力学检测

植入术后26周,取右侧(实验组+对照组)及左侧正常下颌骨标本各3个,以75%乙醇擦净、吹干后,采用SHIMADZU AG-1生物力学测试仪行整骨咬牙合向三点弯曲测试,跨距为30mm,受力截面积设为长方形,位于植入物中部,加载速度0.5 mm/min。所得数据采用配对t检验,SAS 6.12行统计学处理。

2 结果

所有犬种植体植入术后伤口无感染,术后2 d开始进食半流质,1周后进普食。

2.1影像学观察

植入术后4周、12周、26周,X线片可见种植体与实验组及对照组骨质均为良好的骨性愈合(图2),而实验组自12周始种植体局部可见有明显骨痂形成,26周时种植体周围新生骨密度增高。

植入后26周,CT三维重建见种植体与实验组、对照组骨质均愈合,连接紧密无松动(图3A)。Micro-CT示实验组骨密度为(630.09±45.57)mg HA/cm3,对照组为(573.71±43.77)mg HA/cm3,实验组和对照组无明显差异(P>0.05),表明实验组种植体与组织工程骨已愈合,相较种植体与正常骨的愈合无明显差别。

2.2组织学检测

术后26周,取材可见实验组种植体均已与组织工程骨形成紧密的骨样连接;同样对照组也可见种植体与骨质良好结合(图3B)。组织学Van Gieson染色示,实验组与对照组均有较多哈弗氏系统骨结构,种植体与组织工程骨或正常骨间均为紧密骨性连接,实验组未见明显材料残余(图4)。

2.3生物力学检测

种植体植入术后26周,实验组和对照组中央处硬组织的厚度(咬牙合向)和宽度(颊舌向)均无显著性差别(P>0.05),两组所有力学性能也无显著性差别(P>0.05),且最大载荷和最大弯曲强度分别达到正常下颌骨组(左侧)的89.57%±10.54%(实验组)和95.35%±12.01%(对照组)。植入种植体前分别为正常下颌骨组(左侧)的(86.37%±12.03%)和(90.80%± 18.81%)[5],表明组织工程下颌骨力学强度在种植体植入术后26周有进一步增强(表1)。

图2 种植体植入后X线片Fig.2 X-Ray after the im plantation

图3 种植体植入26周标本观察Fig.3 Isolated sample of the canine 26 weeks after im plantation

图4 术后26周样本Van Gieson染色Fig.4 Van Gieson's staining of specimen 26 weeks post-im plantation

表1 下颌骨缺损修复后相关生物数据(均值±标准差)Table 1 Biomechanical data of the repaired mandibular defects(x±s)

3 讨论

创伤、感染、肿瘤切除等导致的下颌骨缺损较为常见,自体骨移植是目前疗效最佳的治疗方法[3],但存在创口感染、血肿形成、神经损伤、取骨区疼痛及继发骨折等诸多并发症[1-2]。组织工程技术有很多优点,如良好恢复损伤组织正常结构和功能,支架材料可任意塑形且对供体部位损伤小。所以,研究应用组织工程技术修复承力下颌骨缺损有重要意义。

组织工程骨在获取种子细胞时对机体损伤小,培养扩增后数量充足,易向成骨方向诱导分化,最终复合可降解支架材料后可形成新生组织工程骨,是目前主要的研究方向[10]。Petite等[11]利用BMSCs复合珊瑚修复了羊跖骨节段缺损,本实验室应用BMSCs复合珊瑚也成功修复了羊股骨节段缺损[8],表明BMSCs-珊瑚修复各类节段骨缺损是可行的。

在此基础上,我们成功应用BMSCs-珊瑚组织工程骨修复了犬下颌骨3cm的标准节段缺损[5],32周时实验组骨缺损均已修复,组织学证明有成熟板层骨形成,实验组骨密度和力学强度与正常组无显著差别,而考虑到口腔特殊环境,仍需恢复并重建下颌骨咬牙合功能。

Boyne等[12]在应用BMP-2复合胶原+钛网固定修复灵长类动物半侧下颌骨缺损时,发现术后6个月局部骨缺损完全修复,此时在修复处植入钛种植体,再接受8个月的咬牙合力刺激,观察到骨密度有显著提高,且未造成局部骨吸收。这提示我们也可引入种植体修复技术来进一步促进骨成熟。

Chen等[13]先将钛种植体插入圆柱形的珊瑚支架内,后从新西兰大白兔的髂骨骨髓中分离出BMSCs,再将细胞种植体支架复合物移植到裸鼠背部。尽管种植体仅需一步就可成功固定在组织工程骨上,但咬牙合力刺激是否会导致种植体松动仍有争议。我们认为,首先应该构建组织工程骨,然后植入种植体,这样种植体才可稳定地促进组织工程骨的成熟。

本实验在BMSCs-珊瑚组织工程骨修复犬下颌骨标准节段缺损32周后,植入种植体改善咬牙合。植入后26周,X线片和CT显示,种植体与实验组及对照组骨性愈合均良好,且实验组种植体周围新生骨密度较高。种植体基台的稳定性可能在骨吸收的早期预测中有非常重要的作用[14],但在我们的研究中,实验组和对照组均未观察到骨吸收,这表明种植体和组织工程骨及正常骨贴合紧密。

实验组骨密度(630.09±45.57 mg HA/cm3)和对照组间无显著性差别。大体标本见种植体与组织工程骨和正常骨均形成紧密连接。组织学显示实验组与对照组均有较多哈弗氏系统骨结构,未见明显材料残余。生物力学测试显示,实验组与左侧正常下颌骨力学强度无显著性差异,且最大弯曲强度达到左侧正常下颌骨的89.57%±10.54%,高于无咬牙合修复的组织工程骨(无种植体植入为正常下颌骨的86.37%±12.03%),表明组织工程下颌骨在种植体植入术后26周成熟度增加,力学强度进一步增强。

本研究证明了BMSCs复合珊瑚后可较好地修复犬下颌骨标准节段缺损,同时植入种植体后可进一步促进骨成熟,生物力学强度增加,我们认为此变化可能是咬牙合力刺激所致。

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Research of Repairing Canine Segmental M andibular Bone Defects by Using Im p lant Combining w ith Bone Tissue Engineering


LIDong1,2,MAO Haoli3,BAIShanshan1,YUAN Jie1,WEIMin1,ZHANGWenjie1,2,LIUWei1,2,CAO Yilin1,2. 1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery;2 Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering;3 Department of Anesthesiology,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011, China.Corresponding author:YUAN Jie(E-mail:jaman1@126.com);ZHANGWenjie(E-mail:wenjieboshi@yahoo.com.cn).

Objective To investigate the effect of repairing canine segmentalmandibular bone defects by using implant combining with bone tissue engineering.M ethods A 3 cm segmentalmandibular defect was created,and the defect was repaired with cell-scaffold constructs formed by in vitro expanded and osteogenically induced BMSCs(P2)and coral. Implantswere embedded into themandible 32 weeks post-operation(n=3);the samewas disposed for the adjacentmandible as control(n=3).Imaging,gross view,histological and biomechanicalmethodswere taken to detect the repairing effects of the bone defect at 4 weeks,12 weeks,26 weeks respectively after implantation.Results A well implant-osseous healing was identified in both experimental group and control group by X-ray and computed tomography(CT)26 weeks after implantation,while the experimental group showed a higher neogenetic bone density around the implant.Micro-CT indicated no significant density difference between the experimental group and the control group(P>0.05).Closely connection were formed between the implant and the normal bone as well as the tissue engineered bone.Histologically,lots ofmature bone trabecula was showed in both groups.No significant mechanical-strength difference was found in mandible between thebiomechanical testing group and the normal group(P>0.05).Conclusion The tissue-engineered bone formed by autologous osteogenic induction of BMSCs and coral can be a favorable remediation of the caninemandible.Additionally,the implanted implant can further promote bonematuration.

Implant;Mandibular reparation;Bonemarrow stromal cells;Coral

Q813.1+2

A

1673-0364(2016)05-0285-04

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.05.004

国家自然科学基金(81471886);上海市科委重点项目(134119a2000)。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科(李东,白珊珊,袁捷,韦敏,张文杰,刘伟,曹谊林);200011上海市上海市组织工程研究重点实验室(李东,张文杰,刘伟,曹谊林);200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院麻醉科(毛豪丽)。

袁捷(E-mail:jaman1@126.com);张文杰(E-mail:wenjieboshi@yahoo.com.cn)。

注:李东,毛豪丽为共同第一作者。

(2016年7月24日;

2016年9月10日)

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