高应瑞+刘珂飞+孟铁健+由天立

摘 要：在3种温度下对大肠杆菌表达重组鸡α干扰素进行了多等温加速稳定性试验和2 ℃保存的稳定性考察，预测重组鸡α干扰素的稳定性，为制品有效期的确定提供依据。采用多等温加速试验， 将制品放在3种不同温度下孵放， 定期取出样品， 测定效价， 根据制品的效价下降情况推算其在有效期内的稳定性。结果显示：用加速降解有关公式可以求出在2 ℃存放1年后的残余效价为226 492 682单位，下降率为9.9%，与实测值228 000 957单位基本吻合；2年后的残余效价为203 868 551单位，下降率为18.9%。即2 ℃保存2年后效价保持在80%以上，推算的结果与试验值较吻合，产品稳定性良好。

关键词：多等温加速试验；重组鸡α干扰素；稳定性

中图分类号：Q81 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.014

Abstract： To forecast the stability of the recombinant chicken interferon α products， and to provide basic information for determining the shelf-life of the products， accelerated stability test was conducted at three different temperatures on E.coli expression of recombinant chicken interferon and stored at 2 ℃ for inspection. By accelerated degradation tests， the products of recombinant chicken interferon α were put at three different temperature conditions for incubation. Some samples were taken out regularly during the incubation in order to test the titer， and to estimate the stability of the products during the shelf-life according to the decline of the titer. The result showed that residual valence for one year after the decline rate was 9.9% at 2 ℃， and was conswastent with the measured value， the residual value after two years of decline rate was 18.9%. In other words， stored at 2 ℃ for two years after the titer remained at more than 80%， the result of calculated the recombinant chicken interferon α had good stability during their shelf-life.

Key words： accelerated degradation tests； the recombinant chicken interferon α； stability

传统的蛋白类药物，特别是干扰素在水溶液中的稳定性较差。为解决这一难题，在研制过程中，笔者作了多方面的努力， 减少了纯化过程中失活， 并在改善成品稳定性方面取得了进展。本研究报道了重组鸡α干扰素的稳定性研究结果， 其中包括加速稳定性试验和2 ℃保存的稳定性考察， 并对加速试验和实地稳定性考察的相关性作了讨论。

1 材料和方法

1.1 重组鸡α干扰素

将重组鸡α干扰素粗品经多步纯化， 比活性达到2.5×108 IU·mL-1以上，加入稳定剂， 除菌、分装。批号为201103221。

1.2 效价测定方法

用微量细胞病变抑制法[1]。检测系统为水泡口炎病毒—VSV攻击病毒。

1.2.1 干扰素溶液的制备 将待测干扰素溶液用含血清的细胞培养液预稀释3倍，在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共9个稀释度，每个稀释度做6孔。

1.2.2 标准品溶液的制备 将标准禽易肽溶液用含血清的细胞培养液预稀释2倍，在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共7个稀释度，每个稀释度做6孔。

1.2.3 常规方法 制水泡口炎病毒接种于96孔板，24 h后，弃去细胞培养板中的上清液，用PBS洗两次后，分别加入不同浓度梯度的干扰素溶液100 μL，于37 ℃，5%CO2培养24 h，弃去细胞培养板中的上清，将保存好的NDV病毒用不含血清的细胞培养液稀释至约100 TCID50，每孔100 μL，于37 ℃，5%CO2培养24 h，当病毒对照中细胞病变达90%以上时，进行结晶紫染色，每孔加染色液50 μL，室温放置30 min，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100 μL，室温放置3～5 min，用酶标仪以630 nm为参考波长，在波长570 nm处测定吸光度。按下式计算：

供试品生物学活性=Pr×[（Ds×Es）/（Dr×Er）]

式中，Pr为干扰素标准品生物学活性；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为干扰素标准品预稀释倍数；Es为供试品相当于干扰素标准品半效量的稀释倍数；Er为干扰素标准品半效稀释倍数。endprint

1.3 试验方法

采用多等温度下加速试验[2-4]。将样品分为4组， 一组放在2～8 ℃下保存作为对照组， 每隔90 d取样测定其效价，其余3组分别放在37，56，66 ℃恒温孵箱内加热， 温差范围均在±0. 5 ℃， 间隔一定时间取样作效价测定。根据不同温度下孵放后效价下降情况， 按一级反应方程log u= log u0-kt （ k为某一恒温条件下的反应速度常数） 求出不同恒温条件下的反应速度常数k， 再利用化学反应速度常数与反应温度的关系， 即Arrhenius 方程log k= α-β/T （T为反应的绝对温度） 推算出低温下的k值， 预测低温下样品的效价， 从而预测低温下样品的稳定性。

2 结果与分析

2.1 样品加温降解试验结果

取一批代表样品在3种温度下降解时，残余效价的对数与加温时间基本上呈直线关系（图1和表1）。这说明鸡a干扰素的降解服从一级反应式：

lg u = lg u0-kt （1）

式（1）中u0为原始效价，u为加温t时间后的残余效价，k为一定温度下的降解速度常数。由图1可以看出，不同温服下降解速度显著不同，66 ℃最快，56 ℃次之，37 ℃最慢。

2.2 计算各温度条件下的降解反应速度常数

按公式（1），将表1的数据作直线回归处理，可求得下列数值，见表2。再根据log k与降解温度T（K）的关系式log k= α-β/T，将已经求出的66 ℃、56 ℃和37 ℃的k值对式log k= α-β/T作回归分析，结果见表2与图2，可求出在8 ℃，2 ℃时的k值（表2），分别为2.032×10-4·d-1和1.247×10-4·d-1。

以2 ℃时的k值代入（1）式，可以求出在2 ℃存放1年后的残余效价为226 492 682单位，下降率为9.9%，与实测值228 000 957单位基本吻合；2年后的残余效价为203 868 551单位，下降率为18.9%。即2 ℃保存2年后效价保持在80%以上。

3 结论与讨论

根据上述结果，可以认为重组鸡α干扰素在2～10 ℃条件下保存1年、2年、3年和10年其效价下降呈现相似的趋势， 重组鸡α干扰素在2年有效期内的效价下降率为18.9%。即2 ℃保存2年后效价保持在80%以上。

稳定性是生物制品的重要质量标准。高温下加速降解试验是一种常见的用于考察生物制品稳定性的方法，根据本试验结果，采用这一方法对于预测制品稳定性具有一定的参考价值。

参考文献：

[1] 中国生物制品规程[M]. 北京： 化学工业出版社， 2000：373-375.

[2] TYDMAN M S， KIRKWOOD T B. Design and analysis of accelerated degradation tests for t he stability of biological standards I， properties of maximum likelihood estimators[J]. J Biol Stand， 1984， 12（2） ： 195-206.

[3]KIRKWOOD T B.Design and analysis o f accelerated degradation tests for the stability of biological standards Ⅲ，principles of design[J].Journal of Biological Standardization，1984，12（2）：215-224.

[4]KUROKAWA M，ISHIDA S，MURATA R，et al.Accelerated degradation tests on some immunological products[J].Journal of Biological Standardization，1979，7（1）：31-41.endprint