吴伟军 彭 敏 韩耀全 施 军 雷建军 王大鹏 何安尤

（广西水产科学研究院，广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西 南宁 530021）

红水河鳙线粒体D-loop和Cyt b基因序列分析

吴伟军 彭 敏 韩耀全 施 军 雷建军 王大鹏 何安尤

（广西水产科学研究院，广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西 南宁 530021）

研究了红水河野生鳙Aristichthys nobilis上游、中游和下游3个群体29个个体的线粒体控制区（D-loop）和细胞色素b（Cyt b）基因序列，通过PCR扩增与测序，分别获得了长度为823bp和1090 bp的D-loop和Cyt b基因片段。分析表明，D-loop序列共定义了15个单倍型，存在17个多态位点，发生转换4次，插入/缺失13次。Cyt b序列共定义了5个单倍型，存在7个多态性位点，发生转换2次，插入/缺失5次。两序列分析结果表明，群体间和群体内遗传距离较小，遗传变异的分子变异等级不显著。上、中、下游均有共享单倍型，3个群体间遗传分化不大。

鳙；红水河；D-loop；Cyt b；遗传变异

鳙（Aristichthys nobilis）属鲤形目，鲤科，鲢亚科，鳙属。也称花鲢、大头、胖头。鱼体侧扁，头极肥大，鳞小，腹面仅腹鳍甚至肛门具皮质腹棱。胸鳍长，末端远超过腹鳍基部。体侧上半部灰黑色，腹部灰白，两侧杂有许多浅黄色及黑色的不规则小斑点。鳙鱼栖息在水的中上层，具有河湖洄游习性，性情温和，不大跳跃，行动较迟缓。鳙以水中的浮游动物，如轮虫、枝角类、桡足类和原生动物为主要食物，兼食多种浮游藻类。

线粒体 DNA 控制区（control region，CR），又称 D-环区（displacement loop region，D-loop），是线粒体 DNA 中的一段非编码区，位于 tRNA Pro 和 tRNA Phe 基因之间，分为 3 个区段：终止序列区、中央保守区和保守序列区。可能由于缺乏编码的压力，是线粒体 DNA 序列和长度变异最大的区域，也是线粒体基因中进化最快的部分，适用于种群水平差异的检测，也可用于种间分析［1-3］。细胞色素 b基因（Cytochrome b gene，Cyt b）是线粒体 DNA 上的蛋白质编码基因，其进化速度适中，适合种群水平差异的检测，也是探讨种内群体遗传分化程度的良好标记［4-5］。本文对红水河流域 3个相互分隔的鲢群体进行遗传多样性状况和群体遗传结构分析，为红水河流域物种的多样性保护提供必要的遗传背景资料和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

采集 3个鳙群体共27条，分别为上游岩滩水库群体（shang）、中游百龙滩水库群体（zhong）和下游来宾市区江段群体（xia），三个群体采样区域有大坝分隔，大坝无过鱼设施，可认为群体间无遗传交流。每尾个体取0.1g背部肌肉新鲜样品，于无水乙醇中保存。

1.2 测序方法

通过液氮研磨、裂解液裂解、有机溶剂抽提，使进入水相的蛋白质与核酸分层，在 RNA 酶的作用下，降解 RNA，得纯度较高的 DNA 样品并进行PCR测序。D-loop 引物序列如下：DL1（5′-ACCCCTGGCTCCCAA AGC-3′），DH2（5′- ATCTTAGCATCTTCAGTG-3′）［6］。Cyt b 引物序列如下：L14724（5′--GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′），H15915（5′--CTCCGATCTCCGGATTACAAG AC-3′）［5］。反应总体积50μL，其中10×Taq Buffer 5μL，Taq Polymer-ase 0.5μL （5 U·μL-1），dNTPs（2.5 mmol·L-1）4μL，Mg2+（25 mmol·L-1）2.5 μL，引物1和2（10 umol·L-1）各μL，模板DNA 50 ng，无离子超纯水35.5μL。扩增条件为：94℃预变性2min后，再进行35个循环，每一循环包括：94℃45s，58℃45 s，72℃1 min；最后72℃延伸7 min。每次PCR反应均设不含模板DNA的空白对照。扩增产物经W=1.5%TBE琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，紫外灯光下检测、拍照。

1.3 分析方法

通过测序获得的序列经 SeqMan II（DNASTAR Inc）软件拼接并人工校对后，用 CLUSTAL-X 程序对所获得的序列进行比对［7］，采用软件 DAMBE 统计单倍型并作图，检测转换、颠换是否达饱和。群体的遗传多样性指标单倍型多样性（Haplotype diversity，H）和核苷酸多样性（Nucleotide diversity，π）由 ARLEQUIN 统计软件计算获得［8］，群体间的分化指数（F-statistics， FST）［9］的计算在 ARLEQUIN 中完成，群体间的基因流由公式Nm=［（1/F ST ）-1］/2［10］计算得出，群体遗传变异的分子方差分析（AMOVA）［11］在ARLEQUIN中完成。采用 MEGA4.1软件统计 DNA 序列的碱基组成［12］，转换/颠换、插入/缺失位点数，单突变位点，简约信息位点；利用Kimura双参数模型计算个体间、群体内和群体间的遗传变异率；用 NJ法进行聚类分析，构建聚类关系树。利用Network4610软件构建单倍型网络关系图。

2 结果

2.1 D-loop和Cyt b基因序列信息

由表1可见，在29个823bp的D-loop基因序列中共检测出15个单倍型。检测到4个单突变位点，13个简约信息位点数；在17个突变位点中：转换位点4个，插入/缺失位点13个。基因片段中，A+T的含量（67.1%）明显高于C+G的含量（32.9%）。29个1090bp的Cyt b基因序列中共检测出5个单倍型，检测到1个单突变位点，6个简约信息位点；在7个突变位点中：转换位点2个，插入/缺失位点5个， A+T的含量（56.4%）高于C+G的含量（43.7%）。对比分析可知：Cyt b单突变位点、多态位点百分比和简约信息位点百分比均小于D-loop。

表1 鲢线粒体D-loop及cyt b碱基组成及变异分析

2.2 D-loop和Cyt b基因序列的遗传变异分析

由表2可见，D-loop序列中，3个鳙群体内的遗传距离分别为0.0051、0.0055和0.0058。上游群体与中游群体间遗传距离为 0.0054，上游群体与下游群体间遗传距离为 0.0055，中游群体和下游群体间遗传距离为0.0054。Cytb基因序列中，群体内的遗传距离分别为0.0014、0.0022、0.0027. 上游群体与中游群体间遗传距离为 0.0019，上游群体与下游群体间遗传距离为0.0021，中游群体和下游群体间遗传距离为0.0023。群体内和群体间差别不大。3个群体的D-loop和Cyt b序列的单倍型多样性 H、平均核苷酸变异数 K、和核苷酸多样性π见表3，群体间的Fst和Nm值见表4，群体间的遗传变异的分子变异等级分析（AMOVA）见表 5，3个群体间 D-loop和Cyt b序列遗传差异不显著（Fst=-0.00147或-0.01188，p＞0.05）。

表2 红水河鳙D-loop和Cyt b基因序列群体内和群体间遗传距离

表3 3个鳙群体相关遗传多样性指标

表4 3个鳙群体间的Fst和Nm

表5 3个鳙群体间的遗传变异的分子变异等级分析（AMOVA）

2.3 分子系统树

以鳙的D-loop和Cyt b基因序列为外群，用NJ法构建分子系统树，其拓扑结构见图1。可见，3个群体的个体混杂在一起，群体间未表现出聚类关系。

图1 红水河3个鳙群体D-loop（左）和Cyt b（右）基因序列的NJ分子系统树

3 讨论

单倍型多样性（H）、平均核苷酸差异数（K）和核苷酸多样性（π）是反映物种遗传变异水平的3个重要参数，3个群体遗传多样性差别不大，群体内和群体间也基本无差别。遗传变异的分子变异等级分析结果为不显著。24个样本的D-loop序列分属15个单倍型，而cyt b序列分属5个单倍型。上、中、下游均有共享单倍型，NJ系统树也显示3个群体并未聚集为独立的分支。由于线粒体DNA为母系遗传，一般不发生重组，表明3个群体间遗传分化不大。

红水河综合利用规划实施后，红水河流域形成了 9个首尾衔接的梯级水库，流水生境绝大部分已经萎缩，天然河道和库区流水江段大为缩短，多数流水性鱼类，特别是产漂流性卵的鱼类，在库区已不具备形成自然种群条件，近十年来，针对产漂流性卵鱼类资源下降的问题，各地政府大力开展了增殖放流活动，由于其他土著性鱼类人工繁育技术成熟度相对较低，苗种获得不易，四大家鱼的放流数量占了各地放流比例的 90%以上。而鳙由于其食性为滤食性，在红水河流域各水库普遍具有富营养化趋势的前提下，不仅在增殖放流中所占比例较大，更是生态网箱养殖和围栏养殖的主要品种。鳙的 3个群体间遗传分化不大，可能是流域开发时间仅三十年左右，原本连通的群体分隔后尚未产生显著遗传分化。也可能是各地增殖放流和生态养殖的鳙，亲本来源较为接近，流域原有的群体因繁殖环境丧失，已经完全被放流群体取代。由于缺乏红水河流域梯级开发前，鲢的遗传多样性分析数据，笔者所在的研究团队拟开展红水河流域鳙捕捞群体和各地放流群体间的遗传多样性对比分析，以明确红水河鳙遗传多样性特征的形成机理。

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Comparison of mitochondrial D-loop and Cyt b sequences of Aristichthys nobilis

Sequences of mitochondfial D-loop and Cytb gene of29 individuals of Aristichthys nobilis which were sampled from three populations in Hongshui River were determined.Using PCR amplification and sequencing，823 bp of D-loop partial sequences and1090 bp of Cyt b partial sequences were obtained.In D-loop sequences，a total of17 polymorphic sites defined15 distinct haplotypes， 4 transition，and13 insert/lacuna loci were found.In Cyt b sequences， 7polymorphic sites and 5 haplotypes were defined，2 transition and 5 insert/lacuna loci were found. Two sequence analysis showed that， within groups and between groups， the genetic distance is small. the genetic variation of molecular variation level is not significant. Upper， middle and lower reaches are shared haplotypes， among three populations little genetic differentiation.

Aristichthys nobilis； Hongshui River； D-loop； Cyt b； genetic diversity

Q349；Q953

A

1008-1151（2016）01-0026-03

2015-12-10

社会公益研究项目（CXIF-2014-006）。

吴伟军（1976-），男（侗族），广西龙胜人，广西水产科学研究院和广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室工程师，从事生态学研究工作。

何安尤（1964-），广西水产科学研究院高级工程师，从事水生动物多样性保护研究工作。