聂简琪，　陈阿娜，　刘秀霞，　杨艳坤，　白仲虎*

（1．粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2．江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122；3．江南大学 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

普鲁兰酶突变体文库高通量筛选方法的建立及应用

聂简琪1，2，3，陈阿娜1，2，3，刘秀霞1，2，3，杨艳坤1，2，3，白仲虎*1，2，3

（1．粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2．江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122；3．江南大学 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

在摇瓶水平实现普鲁兰酶基因 （GenBank Accession No：AX203843）在大肠杆菌BL21（DE3）的异源表达，并成功按规格缩小实现了基于深孔板的高通量细胞培养，同时建立了基于深孔板的普鲁兰酶酶活快速高效的高通量检测方法。利用易错PCR技术对普鲁兰酶基因进行定向进化，突变基因产物重组于表达载体pET-28a（+）-pelB中，并导入大肠杆菌BL21（DE3）构建突变体文库，利用该高通量筛选方法实现了突变体文库的快速高效筛选并获得了一株突变菌株4A4，其表达量提高了46.5%。该方法不仅适用于淀粉酶、纤维素酶等酶类的高通量筛选，同时为菌株文库的筛选以及蛋白质的定向进化提供了一种新思路。

普鲁兰酶；深孔细胞培养板；高通量筛选；规模缩小；突变体文库

普鲁兰酶 （pullulanase）是一类淀粉脱支酶，能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1，6糖苷键，切下整个分支结构，形成直链淀粉，并且可以将最小单位的支链分解，最大限度的利用淀粉原料，近年来在淀粉加工、纺织及饲料行业的需求渐增。……