朱　琳， 贺　巍， 范兴爱， 杨生岳， 刘睿年， 魏廷青

(解放军第四医院消化内科，西宁　810007； *通迅作者，E-mail：hewei.1971@163.com)



急进高原胃动力紊乱大鼠胃电起搏区Cajal间质细胞及P物质表达的变化

朱琳， 贺巍*， 范兴爱， 杨生岳， 刘睿年， 魏廷青

(解放军第四医院消化内科，西宁810007；*通迅作者，E-mail：hewei.1971@163.com)

目的探讨急进高原胃动力紊乱大鼠Cajal间质细胞及P物质(substance P, SP)的表达及其机制。 方法50只SD大鼠以低海拔地区(海拔400 m)为对照组，并以进入高原地区(海拔4 300 m)后的时间节点依次分为1 d,3 d,7 d和14 d组，每组10只。测定各组大鼠胃电活动数据，应用电子显微镜观察胃电起搏区ICC的微观结构变化，应用双重免疫荧光组织化学染色法观察同区域ICC的功能与P物质表达变化。 结果大鼠胃电波幅及波频在进入高原地区后快速下降，于1 d组即可观察到明显变化(P<0.05)，并于3 d下行到最低点(P<0.05)，波频于7 d时恢复正常。电镜下可观察到其胃电起搏区ICC的缝隙连接减少、细胞器减少并出现凋亡小体等，并以高海拔地区3 d组最显著。使用双重免疫荧光组织化学染色法同步标记胃电起搏区ICC细胞和P物质，所得免疫荧光强度同样在高原区3 d组表达下降到最低点(P<0.05)。 结论ICC细胞在急进高原胃肠动力紊乱发生过程中发挥重要作用，而SP则可能通过调节ICC细胞功能的方式，在此过程中扮演重要角色。

高原病；高海拔；胃动力；Cajal间质细胞；P物质；大鼠

急进高原胃肠动力紊乱是高原胃肠应激反应的主要表现之一，其多以恶心、腹胀、食欲减退等消化道症状最为突出，通常经7-10 d的高原适应后可逐渐缓解或消失[1]，但目前有关急进高原胃肠动力紊乱的发生机制尚不完全清楚。ICC不但是胃肠基本电节律(basic electric rhythm)的起始点[2,3]，同时又发挥传导者的作用[4]，是胃肠道壁内神经与平滑肌间的信息传导中介，对P物质、内源性NO、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)等多种胃肠道活性物质有反应[5]，在胃肠动力调控中发挥重要作用。P物质则在胃肠运动调节中起重要的兴奋性作用，在胃肠道内广泛分布。本实验将使用双重免疫荧光组织化学标记的方法观察大鼠胃电起搏区ICC和P物质的表达变化，以探讨急进高原胃动力紊乱过程中ICC的作用机制。

1　材料与方法

1.1主要仪器及试剂

RM6280B生物信号采集处理系统(成都仪器厂)，超低温冰箱(-80 ℃)及超低温切片机(美国NUAIR公司)，FV1000激光共聚焦显微镜(日本OLYMPUS公司)，Tecnai G2分析透射电镜(美国FEI公司)，兔抗大鼠多克隆c-kit抗体(美国LifeSpan BioSciences公司)，小鼠抗大鼠单克隆SP抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)，驴抗兔FITC标记单克隆抗体(英国Abcom公司)，驴抗小鼠alexa fluor单克隆抗体(英国Abcom公司)。

1.2实验动物与分组

雄性SD大鼠50只，6周龄，SPF级，许可证号：SCXK(陕)2012-003，体重(200±20)g，全部购自西安交通大学实验动物中心。以低海拔地区(西安，海拔400 m)为对照组，另以大鼠起运后3 d内进驻实验现场模拟急进高原状态，并以进入高海拔地区(玛多，海拔4 300 m)后的时间节为依据，根据达到实验地区后的时间顺序依次分为1 d,3 d,7 d和14 d组，每组10只大鼠。

1.3胃电生理活动检测

SD大鼠术前12 h禁食，术前6 h禁水，戊巴比妥钠腹腔注射(40 mg/kg)麻醉，在大鼠腹部正中切开，选择胃电起搏区的胃体中部上1/3处浆膜层埋置引导电极[6]，测量胃电活动变化，参数设定为：生物电，500 mV，直流，30 Hz，记录波形并分析。

1.4实验标本的采集与固定

电生理测定完成后，剪开胸腔，经升主动脉插管，快速灌入生理盐水冲洗血液，并沿胃大弯侧剪开，于胃体中部上1/3处取0.2 cm×0.1 cm大小组织，3%戊二醛固定，用于电镜染色，后继续经升主动脉先快后慢灌注冷的(4 ℃)4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB，pH7.4)500 ml，注毕立即取全胃置于20%的蔗糖溶液中过夜沉底。

1.5电镜观察胃电起搏区ICC细胞微观结构变化

取3 %戊二醛固定组织用0.2 mol/L蔗糖磷酸缓冲液漂洗，再用2 %的四氧化锇后固定1 h，丙酮中梯度脱水，在1 %醋酸双氧铀中停滞染色1 h，再通过环氧丙烷与环氧树脂。1 mm切片用亚甲蓝染色，在光镜下观察，确定黏膜层、环形肌层、纵行肌层，再次经70 nm超薄切片后用酒精醋酸双氧铀、再用柠檬酸盐后染色，保留纵行肌层、环形肌层、黏膜下层、部分黏膜层，用透射电镜观察。

1.6双重免疫荧光化学法标记ICC和P物质及图像分析

取固定后胃体中部上1/3处0.4 cm×0.2 cm组织用超低温切片机切片10 μm，使用0.01 mol/L PBS漂洗3次，置入含0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS中浸泡30 min(室温)，经0.01 mol/L PBS液漂洗，进行免疫组织化学荧光染色(以c-kit抗体标记ICC细胞)：分别加入兔抗大鼠多克隆c-kit抗体(1 ∶150)及小鼠抗大鼠单克隆SP抗体(1 ∶200)，室温孵育24 h，经0.01 mol/L PBS液漂洗3次后，分别加入荧光二抗，驴抗兔FITC标记单克隆抗体(1 ∶400)及驴抗小鼠alexa fluor 594单克隆抗体(1 ∶400)，避光室温孵育2 h。经0.01 mol/L PBS洗3次，80%甘油封片，以上过程均需避光操作。各组切片各取10张，在FV1000激光共聚焦显微镜下采用20倍及40倍视野观察，观察每一张切片取6-8个视野，并将数字化图像储存。

1.7统计学分析

2　结果

2.1急进高海拔地区后大鼠胃电生理变化

急进高海拔地区后，大鼠胃电的波频及波幅均受损明显，1 d组即可观察到明显变化(P<0.05)，至3 d组下降到最低点(P<0.05)，此后缓慢恢复，其中波频恢复相对较快，7 d组即基本恢复正常，与低海拔组对比无统计学差异(P>0.05)，而波幅恢复相对较慢，14 d组胃电波幅仍明显低于低海拔对照组(P<0.05，见表1，图1)。

组别 波幅(mV)波频(Hz)低海拔对照组1829.51±627.2349.67±0.62高海拔1d组254.38±40.07*48.27±1.63*高海拔3d组169.21±29.36#44.55±0.93#高海拔7d组271.55±151.24*49.71±1.28高海拔14d组520.63±109.34*49.87±0.77

与低海拔组比较，*P<0.05；与1 d组及7 d组比较，#P<0.05

2.2急进高原后大鼠胃电起搏区的ICC的微观结构变化

低海拔地区对照组ICC在电镜下观察可见：细胞结构完整，缝隙连接紧密，核周细胞质充盈，细胞器数量较多，细胞内部罕见空泡样改变，无凋亡小体。急进高原地区后，1 d组即可明显观察到ICC细胞微观结构受外界环境影响、受损，细胞缝隙连接变得明显松散；细胞内细胞器数量明显减少，线粒体可见空泡样肿胀、变性，部分可见内质网轻度扩张等。而在高海拔地区3 d组中这种受损表现最为明显，除上述改变外，还可见ICC核周细胞质空泡样改变加重，甚至部分ICC基膜不完整形成空洞；可见核固缩形成，核内可见异染色质，凋亡小体显著增多(见图2)。

A.低海拔对照组；B.高海拔1 d组；C.高海拔3 d组；D.高海拔7 d组；E.高海拔14 d组图1　大鼠快速进入高海拔地区后胃电活动时程变化Figure 1　Effects of ascending to high altitude on gastric electrical activity in the rats

2.3急进高原后大鼠胃电起搏区的c-kit及P物质表达的变化

实验结果表明，进入高海拔地区后，大鼠胃电起搏区c-kit表达明显下降，1 d组即出现明显变化(P<0.05)，并于于3 d组下行到最低点(P<0.05)，而后缓慢恢复。本试验中免疫荧光染色可见其表达和ICC细胞呈网络样分布，彼此紧密相邻，表达变化与ICC表达改变同步，均于1 d组即出现改变(P<0.05)，于3 d组表达减少到最低(P<0.05)，而后缓慢恢复(见表2，图3)。

A.低海拔对照组;B.高海拔1 d组;C1，C2.高海拔3 d组;D.高海拔7 d组;E.高海拔14 d组(A，B，E×6 000;C，D×20 500)图2　大鼠快速进入高海拔地区后对胃电起搏区ICC细胞微观结构的影响Figure 2　Effects of ascending to high altitude on ultrastructure of ICC in the rats’ gastric pacing location

组别 c-kitP物质c-kit/P物质低海拔对照组45.30±4.2545.30±4.25 52.24±6.80高海拔1d组33.32±4.13*33.27±4.05* 46.70±4.67*高海拔3d组30.95±3.74*#31.00±3.62*# 36.10±4.13*#高海拔7d组33.14±2.95*32.94±2.84*39.09±4.13*高海拔14d组35.09±3.90*35.09±3.90*42.57±5.23*

与低海拔对照组比较，*P<0.05；与1 d组及7 d组比较，#P<0.05

3　讨论

急进高原的人会因外界气压快速减低引起全身低张性缺氧，引发高原胃肠应激反应。本研究前期实验结果已表明急进高原状态下，进入地区的海拔高度越高，大鼠胃动力下行速度越快，恢复越慢，在海拔4 300 m状态下，于3 d组下行到最低点，且ICC在其中广泛参与，并发挥重要作用[7]。而作为胃肠动力基本功能单位(basical functional unit GI motility, BFUGM)重要组成部分的ICC[8]，在胃内依据功能和部位的不同可划分为肌间ICC(ICC-MY)、肌内ICC(ICC-IM)及黏膜下ICC(ICC-SM)三种[9]。前两种在胃肠运动调控中发挥重要作用，ICC-MY是导致起搏的主要细胞，能自动产生节律性的去极化产生慢波[10,11], 而ICC-IM则能够将ICC-MY产生的起搏信号向下传递给与其形成紧密连接平滑肌，并对神经信号的传递过程进行调节[12,13]。已知的研究表明，肠神经系统(enteric nervous system，ENS)的调控，除了直接作用于平滑肌系统外，主要通过ICC发挥作用，其对乙酰胆碱、SP、NO、VIP等多种神经递质均有反应[5]。P物质在胃部主要可见于肌间神经丛、肌内神经丛及黏膜下神经丛[9]，其作为一种重要的兴奋性神经递质广泛存在于整个胃肠道及ENS[14]，并对胃肠运动调控广泛发挥作用，是研究胃肠动力学领域重要的一种神经递质[15]。

A-E.c-kit表达；A1-E1.SP表达；A2-E2. c-kit/SP;A.低海拔对照组；B.高海拔1 d组；C.高海拔3 d组；D.高海拔7 d组；E.高海拔14 d组图3　大鼠快速进入高海拔地区后对胃电起搏区c-kit及P物质表达的影响Figure 3　Expression of c-kit and substance P(SP) in ICC of gastric pacing region after ascending to high altitude

通过本实验结果可知，急进高原后，伴随着海拔高度的提升，大鼠胃电活动明显受损，在进入实验地域的第1天即发生明显变化，不论是波幅还是波频均明显下行，尤其是波幅更加显著，并于第3天下行到最低点，此后缓慢恢复，波频恢复较快，波幅相对恢复缓慢，与本研究前期试验结果相一致[8]。使用电子显微镜观察各组大鼠胃电起搏区ICC细胞微观结构的变化，也发现类似的损伤变化规律，进入高原后第1天即可发现ICC细胞缝隙连接变得明显松散、细胞器数量减少等现象，至第3天达到顶峰，凋亡小体显著曾多，甚至可见核固缩。而双重免疫荧光组织化学染色结果可以发现，SP的表达变化与ICC的表达改变同步，均于第1天即出现改变(P<0.05)，于第3天表达减少到最低(P<0.05)，而后缓慢恢复。其表达阳性的神经丛与ICC细胞呈网络样分布，彼此紧密相邻并与平滑肌毗邻，提示大鼠胃电起搏区P物质的表达量减低，与胃壁内神经元的兴奋性、胃电基础及平滑肌活动下降存在明显关联性。可见ICC在急进高原胃动力紊乱发生过程中广泛参与，并可能发挥重要作用。而P物质作为一种重要的兴奋性胃肠神经递质，在此过程中可能是通过调节ICC细胞功能的方式发挥作用，并扮演重要角色的。

综上所述，急进高原所致胃动力紊乱的产生，可能与大鼠胃电起搏区ICC细胞功能，及其与P物质的表达变化有关。

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Effects of expression of interstitial cell of Cajal and substance P in gastric electrical pacing region of rats after ascending to high altitude

ZHU Lin, HE Wei*, FAN Xing’ai, YANG Shengyue, LIU Ruinian, WEI Tingqing

(DepartmentofGastroenterology,FourthHospitalofPLA,Xining810007,China;*Correspondingauthor,E-mail:hewei.1971@163.com)

ObjectiveTo explore the substance P expression and the function of interstitial cell of Cajal(ICC) in gastric motility disorders in rats after ascending to high altitude.MethodsFifty SD male rats were divided into five groups(n=10 in each group): low altitude group(Xi’an, 400 m), high altitude(4 300 m) 1 d group, high altitude 3 d group, high altitude 7 d group, high altitude 14 d group. The gastric electrical activity was measured in different groups. Electron microscope was applied to observe the physiological ultrastructure of ICC cells, and the immunofluorescence staining was applied to observe the expression of ICC cells and substance P in gastric electrical pacing region.ResultsThe amplitude and frequency of gastric electrical activity were significantly decreased in high altitude 1 d group(P<0.05), decreased to the lowest in high altitude 3 d group(P<0.05), and the frequency increased to the normal in high altitude 7 d group. The gap junctions and organelles of ICC cells were reduced, and apoptotic bodies were observed in 3 d group under electron microscope. The expression of ICC cells and substance P were also the lowest in high altitude 3 d group(P<0.05).ConclusionThe results indicate that the ICC cells may play an important role in gastric motility disorders in high altitude exposed rats, and substance P may also play an important role to regulate the function of ICC cells in this process.Key words:mountain sickness；high altitude；gastric motility；interstitial cell of Cajal;substance P；rats

青海省(应用)基础研究基金资助项目(2013-Z-760)

朱琳，男，1979-11生，硕士，主治医师，E-mail:298567115@qq.com

2016-08-08

R573

A

1007-6611(2016)10-0890-05DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.10.003