张丽霞　张虹　卞立红　任国领　孟令一　黄永红

摘要：从大庆油田油水采出液中经富集培养、划线分离、溶血圈测定和苯酚硫酸检测等方法筛选出一株产表面活性剂的菌株QS—M2，经生理生化分析和16S rDNA分子生物学鉴定，确定菌株Qs·M2为铜绿假单胞菌，提取其代谢产物经薄层层析和HPLc—Ms鉴定表明：主要的表面活性剂物质是鼠李糖脂类物质，其中单鼠李糖脂的主要组分为RhaC₁₀、RhaC₁₂：C₁₂双鼠李糖脂的主要组分为Rha2C₁₄CC₁₂、Rha2C₁₀C₁₂和Rha2C₁₀C₁₀，该菌株产生的鼠李糖脂可将上清液的界面张力由72.0mN/m降至36.9mN/m，且鼠李糖脂的乳化性能较好，在72 h内乳化性能稳定，结果表明，鼠李糖脂类表面活性剂物质是Qs-M2菌株在微生物提高原油采收率过程中发挥作用的主要因素，

关键词：生物表面活性剂；菌株筛选；界面张力；乳化性能；鼠李糖脂

DoI：10.15938/j.jhust.2016.04.012

中图分类号：TQ920.6

文献标志码：A

文章编号：1007-2683（2016）04-0065-05

0引言生物表面活性剂是由微生物产生的一类严格集亲水基团和疏水基团于一体的具有表面活性的化学物质与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂除具有润湿、乳化、分散、洗涤、起泡、增溶等功能外，还具有低毒性、可降解性和环境友好性、高效性等性能，在石油、环境保护、食品和医药、化妆品、洗化用品等诸多领域具有广泛的应用前景大量研究已经证明，利用微生物产生的生物表面活性剂能够有效的提高原油采收率其主要作用机理是降低油水界面张力，乳化原油，形成水包油的乳化液，提高岩石的亲水性能，然而，在一般的生产过程中，由于生物表面活性剂产量低、生产成本高、纯化工艺复杂，所以目前生物表面活性剂没有大规模的生产采用原油为唯一碳源筛选产生物表面活性剂的微生物菌株，经过驯化得到高效产生物表面活性剂的菌株，不仅降低生产成本而且适应油田环境，可以产生更好的驱油效果。

产生物表面活性剂的微生物主要是细菌和酵母菌，微生物代谢的目前最有效的生物表面活性剂是鼠李糖脂类，其产生菌多为假单胞菌属，假单胞菌属产生的鼠李糖脂的亲水基团一般由1-2分子的鼠李糖构成，疏水基团则由1-2分子具有不同碳链长度的脂肪酸构成，在生物合成过程中，这些基团之间可能相互链接而生成多种化学结构相近的同系物，鼠李糖脂组分的鉴定是阐述鼠李糖脂采油性能的前提和基础，而糖脂类物质的成分鉴定方法则从简易的利用鼠李糖脂水解后测定鼠李糖的色度逐渐发展为利用高效液相色谱一质谱联用、核磁共振等分析样品组成的复杂方法Mata-Sandoval等则利用高效液相色谱法分析得到了由铜绿假单胞菌UG2所产生的鼠李糖脂的主要组成为RhC₁₀Rh2C₁₀C₁₂H₂、RH₂C₁₀C₁₂和Rh₂C₁₀C₁₀，目前，高效液相色谱一质谱联用被认为是目前对鼠李糖脂组分研究最精确的方法之一，

本研究从大庆油田油藏采出液中筛选出一株高产糖脂类生物表面活性剂的菌株QS-M2，对QS-M2菌株进行生理生化分析和分子生物学鉴定；利用薄层层析实验和HPLC，MS方法对提纯的鼠李糖脂组分进行了鉴定和表征；同时，通过对糖脂类物质产量、界面张力、乳化性能等指标的测定，分析了筛选菌株的采油潜力。

1.材料和方法

1.1样品来源

样品来自于大庆油田采油三厂油藏采出液，

1.2培养基

LB液体培养基（g/L）：蛋白胨1%，酵母粉0，5%，NaCI1%，pH 7.0.LB固体培养基（g/L）：LB液体培养基基础上加1.5%琼脂粉，制成平板，石油液体培养基（g/L）：原油5%，NaCl0.21%，NH4cl0.07%，N%HPO₄12%，KH2PO₄0.07%，酵母粉0.6%，MgSOC₄0.5%，pH7.0，血平板培养基：购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.3菌株的筛选和鉴定

1.3.1菌种富集、分离纯化

菌种富集、分离纯化参照文将100 mL石油液体培养基加入250 mL锥形瓶中，121℃灭菌20min，样品接种量为3%，37°C150 rpm培养48 h至培养基浑浊，采用平板划线法进行菌种的分离纯化，将所鉴定的纯菌划线至斜面，37℃培养1 d，4～C保存备用。

1.3.2产糖脂类菌株的筛选

1）产生物表面活性剂菌株的初筛，挑取单菌落接人5mL LB液体培养基，37°C150 rpm培养24h取1mL菌液4°C 12000 rpm离心除菌后，取上清10UL滴在血平板上，37°C培养24 h，观察透明溶血圈的出现筛选产表面活性剂的菌种。

2）苯酚硫酸法筛选产糖脂类菌株，发酵上清液加人0，5 mL 6%苯酚溶液，混匀，加入2，5 mL浓硫酸，混匀，沸水浴10 min，分光光度计490 nm处测定吸光度值，糖脂定性检测中，在490 nm处吸光值显著高于对照组，可确定为产糖脂菌种，

1.3.3产糖脂类菌株的鉴定

1）菌株生理生化分析，菌株的生理生化分析参照文，主要进行了革兰氏染色、淀粉水解、糖发酵、吲哚试验、VP试验、柠檬酸试验、明胶水解试验等。

2）菌株的分子生物学鉴定，菌株的分子生物学鉴定参照文

1.4糖脂类表面活性剂特性研究1，4，1糖脂类表面活性剂的组分鉴定

1）薄层层析实验，薄层层析实验参照文，

2）HPLC—MS鉴定，采用高效液相色谱一质谱联用法对纯化组分进行鉴定，单糖脂和二糖脂主要成分的物质的量百分比由各成分出峰面积的比例近似计算得到。

1.4.2糖脂类表面活性剂的性能检测

糖脂类表面活性剂的提取参照文，对提取的糖脂类表面活性剂进行界面张力、乳化性能和排油圈性能测定，

1）界面张力测定，使用界面张力仪检测上清界面张力，对照组为蒸馏水，

2）乳化性能测定，在20mL乳化管中中依次加入5mL不同浓度的表面活性剂溶液和5mL二甲苯。超声处理3min，静置，分别于Oh、24h、48h、72h观察并记录乳化相体积及变化，

3）排油性能测定，将0，5g苏丹红Ⅲ溶解于100mL液体石蜡中，搅拌均匀后，过滤除去不溶物及杂质，在90 mm平皿中加入30mL蒸馏水，滴加1mL苏丹红Ⅲ染色后的液体石蜡，待液体石蜡散开在水面上铺开形成一层均匀的薄膜后，在石蜡中心处缓慢滴加10txL上清液，观察排油圈直径并记录，

2.结果与讨论

2.1产糖脂类表面活性剂菌株的筛选结果

经富集培养、平板划线分离后，从大庆油田采油三厂油藏采出液中初步筛选出18株微生物菌株，对初筛的21株微生物菌株进行溶血圈检测，如图1所示，共得到14株产生物表面活性剂的微生物菌株，为了进一步筛选产糖脂类表面活性剂的菌株，进行了苯酚硫酸实验，发酵上清液经过在490 nm处吸光值显著高于对照组的菌株，可确定为产糖脂菌种，经过筛选共得到7株产糖脂类菌株，对7株产糖脂类菌株进行液体发酵7 d后，对提取的糖脂类粗品进行称重，其中菌株QS-M2的粗品产量最高，达到了0.725g/L后续实验中用到的菌株均为QS-M2菌株，

2.2产糖脂类菌株的鉴定结果

2.2.1QS-M2菌株的形态及生理生化特征

Qs—M2菌株形态学观察结果和生理生化特征如表l、2所示，QS-M2菌落圆形、表面光滑、浅绿色、边缘整齐、短杆状、菌落中心向上凸起、菌落不透明，QS-M2菌株属于革兰氏阴性菌，VP试验、柠檬酸盐试验、明胶水解试验为阳性，淀粉水解试验、吲哚试验、甲基红试验、硫化氢试验为阴性，

2.2.2 QS-M2菌株的分子生物学鉴定

QS-M2菌株的16S rDNA基因经克隆测序拼接后，在NCBI数据库中进行blast比对，如表3所示，16S rDNA序列分析的结果显示，该菌株为铜绿假单胞杆菌，

2.3QS-M2菌株产生的表面活性剂类型分析和组

分鉴定

2.3.1

薄层层析实验对表面活性剂的定性分析

如图2所示，以鼠李糖作为标准品（左侧），用薄层层析实验对QS-M2菌株产生的糖脂类表面活性剂进行定性分析，结果显示，与对照相似，QS-M2菌株产生的糖脂类表面活性剂显色为黄绿色，表明QS-M2菌株产生的糖脂类表面活性剂为鼠李糖脂，

2.4 QS-M2菌株产生的鼠李糖脂的性能测定

界面张力、排油圈性能和乳化性能是生物表面活性剂性能测定的重要指标_1引，如表4所示，界面张力随着鼠李糖脂浓度的增大逐渐降低并且稳定，最终界面张力由72.0mN/m降低至36.9mN/m，下降了35.1mN/m，排油圈直径随着表面活性剂浓度增大而增加，排油能力增强，

乳化指数是静置24h后乳化体积与总体积的百分比，乳化指数越高说明乳化效果越好，且乳化性能稳定，由表5可以得出，乳化层的体积并非随着表面活性剂浓度的增大而增大，而是达到了一定体积后，随着浓度的增加，乳化层体积下降，与50%吐温20溶液相比，乳化稳定性极高，长达72 h的测量时间里，乳化层体积几乎稳定不变，说明鼠李糖脂的乳化性能较高，并且乳化的稳定性能极好，

3.结论

1）从大庆油田油藏产出水样中经过富集培养、划线分离、溶血圈测定和苯酚硫酸检测等方法筛选出一株产表面活性剂的菌株QS-M2，其发酵产生的糖脂产量为0，225g/L

2）QS-M2菌株经形态学观察、生理生化分析和分子生物学鉴定，该菌株为铜绿假单胞菌（Pseudo，monas aeruginosa）。

3）QS-M2菌株产生的表面活性剂经薄层层析和HPLC-MS鉴定，主要的表面活性剂物质是鼠李糖脂，其中单鼠李糖脂的主要组分为RhaC₁₀C₁₀、RhaC₁₂C₁₂双鼠李糖脂的主要组分为Rha2C₁₄C₁₂、Rha2C₁₀C₁₂和Rha2C₁₀C₁₀。

4）QS-M2菌株产生的鼠李糖脂对上清液界面张力的影响是随着鼠李糖脂浓度的增大逐渐降低并稳定，最终降低界面张力72.0mN/m至36.9mN/m，下降了35.1mN/m；排油圈直径随着表面活性剂的浓度增大而增加，排油性能增强；该鼠李糖脂具有较好的乳化性能，并在72h内乳化性能稳定。