党军龙，周礼红

(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳550001；2.贵州大学 生命科学学院真菌资源研究所，贵州 贵阳550001)



·研究简报·

抗癌肽改造及其对人乳腺癌MCF7作用的评估

党军龙1，周礼红2*

(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳550001；2.贵州大学 生命科学学院真菌资源研究所，贵州 贵阳550001)

为了探讨不同净电荷及疏水度对天然多肽CMAP-8衍生物抗人乳腺癌细胞MCF7增殖抑制作用的影响，分别采用带正电荷的K和疏水性的F两种氨基酸对天然多肽CMAP-8进行设计改造，得到系列衍生物。其净电荷数为0～8，疏水度为42%～57%，采用MTT法检测所得多肽衍生物对人乳腺癌细胞MCF7的增殖抑制率，AntiCP对多肽抗癌活性的预测。结果表明，净电荷为0的多肽均没有预测抗肿瘤活性，可能是因为多肽的净电荷对其预测活性有一定的影响。体外抗乳腺活性结果表明，CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25对MCF7细胞的抑制率与CMAP-8相比，差异达到了极显著水平(Duncan-test，P<0.01)。所筛选的4条多肽净电荷数为6～8，疏水度均为46%，而天然多肽CMAP-8净电荷为0，疏水度为42%。多肽活性预测结果与体外抗乳腺癌检测结果一致，共同表明了净电荷的改变对多肽抗乳腺癌活性的影响更大，而疏水度并非越大越好，应该处在合适的范围内。

净电荷；CMAP-8；乳腺癌；抑制作用

乳腺癌是女性群体中最常见的癌症，每年新增的乳腺癌患者可达138万人[1]。WHO调查表明，2014年中国女性中乳腺癌患者已达到187213人，在所有女性癌症种类中位列第二。根据乳腺癌细胞表面ER、PR、HER2和Ki-67分子的表达差异，可将乳腺癌细胞分为Luminal A、Luminal B、HER2/neu和Basal-like四个亚型[2-4]。目前，化疗是治疗乳腺癌的一个标准疗法。但是，化疗药物由于缺乏特异性往往会导致强烈的副作用，并且反复使用还会导致肿瘤多药耐药性的形成[5-7]。因此，需要不断探索具有新机制的抗肿瘤药物，以补充抗肿瘤药物的资源库。

由于乳腺癌细胞膜表面通常会高表达磷脂酰丝氨酸、O-糖苷粘蛋白唾液酸、和肝素等富含阴离子的分子，因此阳离子两亲性的抗癌肽(Anticancer peptides，ACPs)可以通过静电引力与膜表面的这些分子相互作用而定位到细胞膜上，进而在膜上聚集镶嵌在细胞膜上或者渗透进入细胞内，通过干扰细胞膜的整合而使细胞裂解或者诱导细胞凋亡[8-9]。ACPs因其广泛的来源和多样而独特的作用机制已经成为开发新型抗肿瘤药物的候选药物之一。由于微生物细胞膜表面和肿瘤细胞膜表面一样，都富含负电荷的糖脂和(或)糖蛋白，因而很多抗菌肽(Antimicrobal peptides，AMPs)往往同时兼备抗菌和抗肿瘤的双重作用[9-10]。

根据抗癌肽数据库CancerPPD (http://crdd.osdd.net/raghava/cancerppd/browsetissue.php)的统计，目前至少有300条具有抗乳腺癌活性的多肽[11]。但是，已有的多肽活性各异，对乳腺癌细胞的IC50从3 μM到大于100 μM不等，其溶血活性普遍较高，在10 μM的浓度下就有较强的溶血活性。为了克服以上因素的限制，需要设计出一些合理的策略对已经发现的ACPs进行改造，以改善其抗肿瘤活性。目前，根据影响 ACPs 抗肿瘤活性的理化性质及结构特点，可从5个方面对抗癌肽进行改造设计[12-16]:(1)通过单个氨基酸残基的剔除和(或)者替换对天然的模板进行修饰；(2)改变序列中氨基酸的位置，对多肽序列进行优化；(3)将具有不同性质的多肽序列模体进行杂合，以得到性能更好的多肽；(4)根据ACPs存在的一些明显的缺陷进行针对性的改造；(5)借助于计算机和已经建立起来的数据库可以对ACPs进行更加科学和理性地设计改造。

虽然采用以上方法对ACPs设计改造可以使改造后的多肽抗肿瘤活性有显著的提高，但是ACPs的净电荷和疏水度究竟是如何影响其抗肿瘤活性的至今鲜有报道。为此，本文报道了蛹虫草来源的天然多肽CMAP-8的改造及其对人乳腺癌细胞MCF7抑制作用的研究结果，以初步探究ACPs的净电荷和疏水度对其抗乳腺癌活性的影响。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1天然多肽和细胞株多肽CMAP-8(KDLLSAMLSGVDPK)由贵州大学真菌资源研究所从蛹虫草(Cordyceps militaris)中分离所得；人乳腺癌细胞MCF7保存于贵州医科大学组织工程与干细胞研究中心。

1.1.2试剂DMEM培养液(HyClone公司)；北美胎牛血清(SCIENCELL公司)；精蛋白生物合成人胰岛素(诺和诺德(中国)制药有限公司)；四甲基噻唑蓝(MTT)(北京索莱宝科技有限公司)，溶于PBS中配成5 mg/mL的溶液，用0.22 μM滤膜过滤；二甲基亚砜(DMSO)(天津市致远化学试剂有限公司)。

1.2方法

1.2.1抗菌肽的改造抗菌肽CMAP-8(KDLLSAMLSGVDPK)由贵州大学真菌资源研究所从蛹虫草(Cordy-ceps militaris)中分离所得，其对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的MIC为16 μg/mL。为了探究净电荷和疏水度对ACPs抗乳腺癌细胞MCF7活性的影响，以CMAP-8为模板进行设计改造。首先对APD[17]和CancerPPD数据库中具有抗乳腺癌活性多肽的理化性质(一级序列、氨基酸残基的数目、多肽构象、抗癌活性、净电荷和疏水残基的百分比)进行分析。随后，根据对所得信息分析的结果，选择K和F两种氨基酸分别从净电荷和疏水残基百分比两方面对CMAP-8进行设计改造，得到系列多肽。用AntiCP：http://crdd.osdd.net/ragh-ava/anticp/index.html[18]预测多肽的抗肿瘤活性，CellPPD：http://crdd.osdd.net/raghava/cellppd/index.html[19-20]预测多肽的渗透性。ToxinPred：http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/[21]预测多肽的毒性。

1.2.2多肽合成与纯化所有多肽均由上海波泰生物科技有限公司(Shanghai Bootech BioScience &Tech-nology Co.，Ltd) 采用Fmoc/PyBOP固相合成法合成，再用反向高效液相色谱仪(Reverse-phase high-perfo-rmance liquid chromategraphy，RP-HPLC)纯化。纯化后多肽(纯度为98%)的分子量和纯度分别用质谱仪和高效液相色谱仪(High-performance liquid chromatography，HPLC)测定。所有的多肽均以干冻粉的形式封装保存。

1.2.3 细胞培养MCF7细胞培养于含10% FBS、0.2 U/mL人胰岛素、1%非必需氨基酸、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM完全培养液中，在37 °C，5% CO2，100%湿度的条件下培养。

1.2.4抗癌活性测定培养细胞，在状态好时收集对数期的细胞用完全培养液将细胞吹打成单细胞悬液，倒置显微镜下计数。用完全培养液稀释细胞悬液，以6×103个/孔的浓度加入到96孔板中，每孔100 μL。37 °C，5% CO2，100%湿度下培养24 h以保证细胞状态良好，贴壁正常。加药处理，多肽溶液经完全培养液稀释后加入96孔板，使其终浓度为100 μM，药物加入后每孔中液体总体积为200 μL。与多肽药物等体积的PBS溶液做同样处理后加入96孔板作为阴性对照，另外直接加入100 μL的完全培养液作为空白对照。药物处理完成后，在37 °C，5% CO2，100%湿度的细胞培养箱中继续培养24 h。无菌条件下每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，继续在培养箱中孵育2 h。测量结果，弃去孔内培养液，每孔加入200 μL DMSO，振荡使甲瓒结晶充分溶解，在570 nm处测OD值。计算细胞存活率(%)=(测试组OD值)/(空白组OD值) ×100%

1.2.5数据处理实验数据采用SPSS 20.0进行统计学分析，并用GraphPad Prism 5.0进行作图。

2　结果与分析

2.1多肽设计结果

以天然多肽CMAP-8为模板，采用带正电荷的K和疏水性的F两种氨基酸对其进行设计改造，得到了13条多肽衍生物(见表1)，其净电荷数为0～8，疏水度为42%～57%。AntiCP对多肽抗癌活性的预测结果表明，净电荷为0的天然多肽CMAP-8和其衍生物CMAP-L-1均无预测抗癌活性，而除此之外的其他净电荷大于0的多肽衍生物均具有预测抗癌活性。同时，CellPPD对多肽细胞渗透性的预测结果表明，天然多肽CMAP-8、多肽衍生物CMAP-L-1、CMAP-L-2和CMAP-L-4疏水度均为42%，但是前两条多肽具有预测抗癌活性而后两条却没有。其原因可能是AntiCP服务器对抗癌肽活性的预测是根据多肽净电荷的有无来判断的，与其疏水度关系不大。因此，与疏水度相比，多肽的净电荷可能对其抗癌活性影响更大。ToxinePred对多肽毒性的预测结果表明，所有多肽均无细胞毒性。这表明，多肽净电荷和疏水度对其预测细胞毒性均无明显的影响。

表1　多肽衍生物的序列及分子特征

注:“+”表示预测多肽有该性质，“-” 表示预测多肽没有该项性质。

2.2多肽对MCF7细胞的抑制作用

采用MTT法检测了多肽对MCF7细胞的抑制率，结果表明，CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25在100 μM的浓度下，作用MCF7细胞24 h后细胞存活率分别为57.4%、50.5%、70.9%和64.1%(见图1)，与CMAP-8相比差异达到了极显著水平(Duncan-test，P<0.01)。抗癌活性预测结果中凡是带正电荷的多肽均具有预测抗癌活性，但实际检测的结果却只有净电荷数较高的多肽衍生物对MCF7细胞有相对较好的抑制活性，其原因可能是AntiCP服务器对抗癌肽的活性是根据多肽的理化性质定性进行预测的，并不能根据其理化参数的大小定量预测。比如，根据多肽电荷的有无来预测多肽是否具有抗癌活性，若有，则认定其具有抗癌活性，反之则无。实际上，多肽净电荷数的大小对其抗癌活性有较大的影响，4条抑制作用较好的多肽衍生物净电荷数为6～8，而其他的多肽衍生物尽管具有一定的净电荷，但是可能因为数目太少，不能优先发挥抗癌作用。这表明，净电荷对多肽抗乳腺癌活性具有显著的影响，净电荷数超过多肽链长的一半则抗乳腺癌活性会显著提高。疏水度的变化与多肽抗乳腺癌活性之间没有明显的关系，但是活性较好的多肽其疏水度应该在合适的范围内，并非越大越好或越小越好。例如，多肽CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25的疏水度均为46%，比天然多肽(42%)相略高一点，但其对MCF7细胞的抑制作用却差异较大，而多肽衍生物CMAP-L-11疏水度最高(57%)，但其抗乳腺癌活性却没有明显的增加。

图1　多肽衍生物对MCF7细胞的抑制作用Fig.1　Inhibition of the derived peptides against MCF7

3　讨　论

本试验从天然多肽CMAP-8(净电荷为0)出发得到的多肽衍生物中，所得具有显著抗乳腺癌活性的多肽CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25净电荷数为6～8，表明净电荷的增加会导致多肽抗乳腺癌活性的增加。黄宜兵等[22]用多肽P通过同样的改造后作用于HeLa 299人宫颈癌细胞后也发现净电荷的增加可以增加多肽的抗癌活性。其原因可能是诸如MCF7乳腺癌细胞和HeLa 299人宫颈癌细胞一类的癌细胞表面通常会高表达带负电荷的分子，例如，磷脂酰丝氨酸、O-糖苷粘蛋白唾液酸、和肝素等[8]，后者与ACPs通过静电吸引是保证ACPs能够入侵癌细胞发挥抗癌活性的基础。但是，黄宜兵等[22]同时也指出，净电荷的过度增加也会导致多肽抗癌活性的降低，其原因可能是净电荷过多会增加分子内部和分子间的静电排斥作用，影响多肽二级结构的形成，进而影响多肽与癌细胞的互作。

本试验还发现，在保证ACPs的净电荷在一定的水平之外，疏水度也对其抗乳腺癌活性有一定的影响。但是，疏水度并非越大越好，应该是处在合适的范围内。例如，多肽CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25的疏水度均为46%，比天然多肽(42%)相略高一点，但其对MCF7细胞的抑制作用却差异较大，而多肽衍生物CMAP-L-11疏水度最高(57%)，但其抗乳腺癌活性却没有明显的增加。其原因可能是，多肽疏水度的降低虽然有利于其水溶性的增加但是不利于多肽与癌细胞的细胞膜接触，从而也不利于多肽发挥抗癌活性，但是疏水度的过度增加也会影响多肽的水溶性，同样不利于多肽抗癌活性的发挥。

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Transformation of anticancer peptides and the evaluation of their anticancer activities against MCF7 human breast cancer cells

DANG Jun-long1，ZHOU Li-hong2*

(1.School of Pharmaceutical Science，Guizhou University，Guiyang,Guizhou 550025，China;2.Institute of Fungus Resources，College of Life Science，Guizhou University,Guiyang,Guizhou 550025,China)

Positive charged lysine and hydrophobic phenylalanine were employed to transform the naturally occurred peptide CMAP-8 in order to explore the effects of net charge and hydrophobicity on anticancer activity of anticancer peptides (ACPs) against MCF7 human breast cancer cells.A sequence of derived peptides was transformed,with the net charge and hydrophobicity ranged from 0 to 8 and 42% to 57%,respectively.The anticancer activities of the peptides predicted by AntiCP demonstrated that all the peptides without net charge did not show predicted anti-tumor activities.The proliferating inhibitory effects results indicated that the inhibitory effects of peptides CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24 and CMAP-L-25 on MCF7 were highly significant (Duncan-test,P<0.01),compared with natural CMAP-8.The effect may attribute to the net charge of the peptides affecting the anticancer activities.The net charges of the four screened derived peptides (CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24 and CMAP-L-25) ranged from 6 to 8,and their hydrophobicity were all at 46%,compared with the net charge and hydrophobicity of the natural peptide CMAP-8 of 0 and 42%,respectively.The predicted anticancer activities of the peptides were consistent with the in vitro test results,which indicated that the net charge of ACPs plays a more significant role in their anti-tumor activities against breast carcinoma cells.However,the higher hydrophobicity is not necessary better and it should be in an appropriate range rather than be much higher.

Net charge;CMAP-8;Breast cancer;Inhibitory effect

2016-05-30；

2016-06-10

“十二五”农村领域国家科技计划课题子课题(2012BAD33B06)。

周礼红，女，副教授，博士，硕士导师，主要研究方向：微生物遗传与育种、发酵工程；E-mail:lhzhou33@126.com。

R979.1+9

A

1008-0457(2016)04-0072-05国际

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.04.013