刘宗正 ，李和刚 ，程 明 ，杨培培 ，赵金山

（1.山东省青岛市畜牧兽医研究所，山东 青岛 266041；2.青岛奥特种羊场，山东 青岛 266041）

利用JIVET技术快速繁育萨福克羊的研究

刘宗正1，2，李和刚1，程 明1，2，杨培培1，赵金山1

（1.山东省青岛市畜牧兽医研究所，山东 青岛 266041；2.青岛奥特种羊场，山东 青岛 266041）

JIVET技术是一项利用生殖激素刺激幼畜卵巢，从而使其快速、高效生产卵母细胞的技术。对4只1月龄萨福克幼羔注射FSH和PMSG激素，48 h后采用手术法抽取幼羔卵母细胞，并在体外成熟；将成熟的卵母细胞与精子进行体外受精，将正常分裂的2～8细胞胚胎移植到6只同期发情的受体小尾寒羊子宫内。结果显示，采用激素法处理萨福克幼羔后共采集到可用卵母细胞109枚，体外成熟培养后得到成熟卵母细胞79枚，成熟率为72.48%；体外受精后得到正常卵裂胚胎34枚，卵裂率为43.04%；胚胎移植后有3只受体母羊怀孕，受胎率为50%，并分娩得到3只萨福克幼羔。综上提示，利用JIVET技术可以缩短萨福克羊的繁育周期，从而加快其繁育速度。

萨福克羊；JIVET技术；幼羔；生殖激素；胚胎移植

幼畜超排技术 （juvenile superovulation technology，JIVET）是利用幼龄母羔（1～2 月龄）性成熟前的卵巢对生殖激素敏感，且卵泡很少发生闭锁的特殊生理特点而发明的一项高效生产羊卵母细胞的新技术［1］。20世纪90年代的研究发现，利用激素诱导法获得的羔羊卵母细胞完全可以生产出早期胚胎，其卵裂率和囊胚率可分别达到63%和20%。Armstrong［2］将利用该项技术获得的卵裂胚胎移植到受体母羊子宫后发现，妊娠率可达30%～45%，并培育出了后代。在生产过程中，超数排卵（multiple ovulation，MO） 与活体 采 卵 技 术 （ovum pick-up，OPU）的结合在一定程度上提高了获取较高质量卵母细胞的能力，从而可以生产出更优质的胚胎。近年来的研究结果表明，羔羊处在4～8周龄时，激素诱导后的卵母细胞生产体外胚胎的效率最高［3-5］。

随着社会经济的发展和生活水平的不断提高，人们对动物性产品的需求量也越来越大。因此，加快对优质绵羊等家畜繁育技术的研究与应用也成为重要的研究课题。笔者以萨福克绵羊为对象，利用JIVET技术开展萨福克绵羊的快速繁育研究，以期为该项技术的应用和推广提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 4周龄左右的萨福克羔羊4只，繁殖功能正常的24～36月龄小尾寒羊6只（受体羊）。实验羊只均由青岛奥特种羊场提供。冷冻精子采自成年健康萨福克公羊，并进行颗粒冷冻。

1.2 主要试剂 透明质酸酶：Sigma，H3506；DMEM/F12（1∶1）：HYCLONE，SH30004；胎牛血清：Sigma，10099； 垂 体 促 卵 泡 素 （FSH）：Sigma，DIN00867357；孕马血清（PMSG）：宁波第二激素厂；L -Glutamine：Sigma，G3126；Medium 199：Gibco，12350；LH：Sigma，L5269；6-DMAP：Sigma，D2629；离子霉素：Sigma，10634。

1.3 幼羔超数排卵及受体羊的同期发情 萨福克幼羔的超数排卵：幼羔手术采卵前48 h注射FSH 40 mg，注射PMSG 400单位，以后每隔12 h注射FSH 40 mg，直至最后一次注射FSH后12 h进行手术采卵。受体羊的同期发情：试验开始前14 d，将CIDR栓放入受体母羊阴道中，胚胎移植前2 d时撤栓，并注射PMSG 400单位，第2天试情，将发情母羊做好标记，用于胚胎移植。

1.4 卵母细胞的采集及体外成熟 采用手术法抽取羔羊卵巢上的卵泡，清洗卵巢2次后，用预装有2～3 mL 采卵液 （M199+NaHCO3+1 μg/mL 肝素+2 mg/mL BSA）的注射器进行抽卵，收集卵泡液，并在体视显微镜下挑选卵丘细胞包裹的卵母细胞用于成熟。按未成熟卵母细胞20～25枚拣入100μL成熟液微滴中的比例进行卵母细胞体外成熟，在38.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度的培养箱中进行培养。培养18 h后去除卵丘细胞，挑选第一极体排出的裸卵用于下一步的体外受精。

1.5 体外受精 将冷冻的萨福克公羊精子颗粒从液氮罐中取出，直接投入带有2 mL获能液的试管中进行体外获能，利用TALP液上游法，上游15～20 min，取上清液2 000 r/min离心3 min，去除上清液，调整精子密度为（6×106）～（9×106）个/mL，加入到装有成熟卵母细胞的成熟液微滴中，在4孔板内精卵共孵育（在38.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度的培养箱中过夜培养）。18～24 h后挑选卵裂的胚胎进行体外培养。

1.6 胚胎移植 将同期发情的受体羊保定，刮净绵羊右下腹被毛，碘酒消毒，脱碘。手术刀切开腹部，暴露子宫和卵巢，根据卵巢黄体的状况和发情时间确定移植胚胎的胚龄和数目。2～4细胞期胚胎移入输卵管壶腹部，桑葚胚和囊胚移入子宫角。

2 结果与分析

2.1 激素对幼羔超数排卵的影响 萨福克幼羔注射FSH+PMSG激素后，利用手术法抽取幼羔的卵母细胞，4只幼羔经激素处理48 h后，卵泡的发育情况差异较大，共获得可用卵母细胞109枚（见表1）。

表1 幼畜超数排卵试验结果

2.2 体外受精 卵母细胞在体外成熟培养18 h后（见图1A）去除卵丘细胞，挑选排出第一极体的卵母细胞（见图1B），统计成熟率。将成熟的卵母细胞进行体外受精，精卵共孵育18 h后，挑选卵裂胚胎（见图2），统计卵裂率。卵母细胞的成熟率及其体外受精后的卵裂率统计结果见表2。由表2可知，体外成熟培养后得到成熟卵母细胞79枚，成熟率为72.48%；体外受精后得到正常卵裂胚胎34枚，卵裂率为43.04%。

图1 卵母细胞的体外成熟

表2 卵母细胞体外成熟率及其体外受精后的卵裂率统计结果

2.3 胚胎移植及分娩 将卵裂的胚胎进行胚胎移植，通过判断受体母羊的黄体发育情况确定胚胎移植的部位和数量。共移植卵裂胚胎34枚，移植受体羊6只。胚胎移植后1个月，通过人工试情的方法，发现在孕后期共有3只受体羊正常妊娠，妊娠率为50%。顺产生下萨福克羊羔共计3只。

图2 卵裂胚胎

3 讨论

超数排卵技术是一种利用外源促性腺激素诱发动物卵巢卵泡发育，并排出卵子的技术。在该研究中，笔者采用的JIVET技术主要利用了1～2月龄的母羔卵巢对生殖激素的敏感性较强、卵泡很少闭锁、在注射促性腺激素后可激发产生大量卵泡的特殊生理特点［6］。目前，该项技术已经成为家畜繁殖技术领域的研究热点，不仅能够加快家畜的繁育和改良速度，而且还为家畜胚胎的商业化生产和应用提供了广阔的发展前景。

在该研究中，笔者对4只1月龄萨福克绵羊幼羔进行超数排卵处理，结果表明，在相同的激素处理条件下，不同羊只对激素的敏感程度存在差异，其中，只有1只羊反应相对较好，产生了较多的卵泡，2只幼羔对激素的反应一般，而另外1只只产生了较少的卵泡。该试验共获得可用卵母细胞109枚，采卵水平较低。此外，卵母细胞在体外成熟后，共得到成熟卵母细胞79枚，成熟率为72.48%；体外受精后，共有34枚胚胎卵裂，卵裂率为43.04%；共移植34枚胚胎，胚胎移植妊娠率为50%。此前，参与该研究的中国农业大学在其他地区采用相同处理方法得到的卵裂率和妊娠率分别为31.8%～73.5%、41.2%～66%，表明该研究结果较为理想。受体羊顺利分娩后得到3只萨福克羔羊，证明利用JIVET技术快速繁育萨福克绵羊是可行的。

目前的研究认为，羔羊在4～6周龄时的超数排卵效果最佳，此外，最新的研究结果也认为不同的品种以及基因等遗传背景对幼畜超数排卵效果也有一定的影响［7-8］。 李运生等［9］研究发现，幼畜超数排卵的季节和母畜怀孕期间的营养水平也对超数排卵的效果有影响。该研究中，笔者仅选取4只幼羔进行了超数排卵处理，并未进行大量的重复性试验，且获得的卵母细胞数量较少，这可能与进行超数排卵处理的季节有关［10-11］。该研究在2月进行，正处于冬季，对幼羔产生了一定影响；此外，卵母细胞的体外成熟率和卵裂率等数据都处于正常水平，表明前期建立的相关技术体系相对成熟。

4 小结

该研究系统地掌握了幼畜超排技术（JIVET）的激素超数排卵、卵母细胞的体外成熟、体外受精、胚胎移植等技术方法。利用JIVET技术可以缩短萨福克羊的繁育周期，从而为该项技术的进一步研究和推广应用奠定了基础。

［1］李文娟，字向东.羔羊超数排卵及体外胚胎生产技术的研究与应用进展［J］.畜牧与兽医，2014，46（7）：35.

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［3］EARL C R，IRVINE B J，ROWE J P，et al.Production of in vitro matured oocytes from 6 week old calves［J］.Proc Aust Soc Reprod Biol，1994，26：15.

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［6］KELLY J M，KLEEMANN D O，WALKER S K.Enhanced efficiency in the production of offspring from 4-to 8-week-old lambs［J］.Theriogenology，2005，63（7）：1876-1890.

［7］陈晓勇，田树军，敦伟涛.幼畜（牛羊）超数排卵技术研究进展［C］//河北省畜牧兽医科技创新论坛论文集.石家庄：河北省畜牧兽医局，河北省科技厅星火计划办公室，河北省自然科学基金委员会办公室，2007：5.

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［9］李运生，曹鸿国，刘亚，等.羔羊超数排卵与胚胎体外生产技术研究进展［J］.动物医学进展，2011，32（11）：99-104.

［10］郭洪，万鹏程，代蓉，等.羔羊卵母细胞体外胚胎生产影响因素分析［J］.湖北农业科学，2013，52（19）：4726-4729.

［11］刘志涛，田树军，陈晓勇，等.幼畜卵母细胞体外发育能力研究进展［C］//中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（上册）.天津：中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会，2010：5.

Study on Rapid Propagation of Suffolk Sheep by Using JIVET Technology

LIU Zong-zheng1，2，LI He-gang1，CHENG Ming1，2，YANG Pei-pei1，ZHAO Jin-shan1
（1.Qingdao Municipal Institute for Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Shandong Province，Qingdao 266041，China；2.Qingdao Aote Sheep Breeding Farm，Qingdao 266041，China）

JIVET is a technique using reproductive hormone to stimulate ovarian of young stock to rapidly and efficiently produce oocytes.In this study,in order to evaluate the application performance of JIVET in rapid propagation of Suffolk Sheep,4 onemonth-old lambs of Suffolk Sheep were selected and intramuscularly administrated with FSH and PMSG.Forty-eight hours after administration of reproductive hormone,the oocytes were collected by surgery and were subsequently matured in vitro.The matured oocytes were fertilized with prepared frozen semen in vitro.When the embryos grew to 2 to 8 cells each,they were transferred into the uterus of 6 receptor female sheep.The results revealed that a total of 109 available oocytes were obtain after the treatment of reproductive hormone and 79 of them were successfully matured in vitro,and the maturation rate was 72.48%.A total of 34 cleaved embryos were obtained after fertilization in vitro and the cleavage rate was 43.04%.Three receptor female sheep was pregnant after receiving embryo transfer and the pregnancy rate was 50%.Finally,3 lambs of Suffolk Sheep were obtained.These results suggest the fact that the application of JIVET can shorten the breeding cycle of Suffolk Sheep and thus speed up the breeding of Suffolk Sheep.

Suffolk Sheep；JIVET；lamb；reproductive hormone；embryo transfer

S826.3；S813.3

A文章顺序编号1672-5190（2016）03-0001-03

2015－12－08

项目来源：青岛市民生计划项目（13-1-3-88-nsh）。

刘宗正（1985—），男，助理畜牧师，博士，主要从事发育生物学研究工作。

赵金山（1975—），男，高级畜牧师，博士，主要研究方向为动物遗传与育种。

（责任编辑：赵俊利）