李娟娟　李　洋　杨　青,2△

(1复旦大学生命科学学院生物化学系　上海　200438; 2 云南天然产物与生物制药协同创新中心　昆明　650091)



人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2的表达与纯化

李娟娟1李洋1杨青1,2△

(1复旦大学生命科学学院生物化学系上海200438;2云南天然产物与生物制药协同创新中心昆明650091)

目的构建人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2 (human indoleamine 2,3-dioxygenase-2,hIDO2)原核表达载体,表达、纯化获得hIDO2蛋白。方法采用基因工程手段获得hIDO2原核表达载体并转化表达菌株,筛选合适的重组质粒及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)浓度进行蛋白表达;通过亲和层析纯化重组hIDO2,BCA法测定蛋白浓度并计算蛋白收率;SDS-PAGE电泳检测hIDO2表达情况,通过软件分析得到蛋白纯度;Western blot检测目的蛋白特异性。结果重组质粒经电泳分析、双酶切、DNA测序鉴定表明构建成功;经筛选发现重组质粒pET28a-hIDO2比pGEX-4T-1-hIDO2的hIDO2表达效果好;SDS-PAGE电泳及Western blot均验证了在相对分子质量45 000处的特异性目的条带的存在;经测定及计算得出蛋白纯度为97.1%,蛋白浓度为20 mg/mL,蛋白收率为15 mg/L。结论成功构建重组质粒用于表达及纯化hIDO2,蛋白浓度、纯度、收率及特异性均较高。

吲哚胺2,3-双加氧酶-2;人源;蛋白表达;蛋白纯化

吲哚胺2,3-双加氧酶-2 (indoleamine 2,3-dioxygenase-2,IDO2),是继吲哚胺2,3-双加氧酶-1 (indoleamine 2,3-dioxygenase-1,IDO1)、色氨酸双加氧酶 (tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)之后,第3个被发现能够催化色氨酸沿着犬尿氨酸途径 (kynurenine pathway,KP) 代谢的限速酶,可催化色氨酸分解产生L-犬尿氨酸、喹啉酸等多种具有生物活性的代谢产物[1]。其中TDO主要存在于肝脏中,受糖皮质激素及L-色氨酸的诱导[2],尚未发现其免疫调节活性[3];IDO1 广泛分布于除肝脏以外的其他组织中,是细胞内的一种含亚铁血红素的单体蛋白质,1967年首次在兔肠道细胞中被发现[4]。……