鲍俊杰　叶爱华　邱先桃　施少清　刘慧姝



·基础研究论著·

IL-17在米非司酮诱导的早产大鼠模型外周血中的表达水平及其意义

鲍俊杰叶爱华邱先桃施少清刘慧姝

目的探讨米非司酮诱导的早产大鼠模型外周血中IL-17的表达水平及其意义。方法 SPF级10～12周龄Sprague-Dawley大鼠适应性喂养1周后雌雄合笼，阴道涂片发现精子者标记为妊娠第1日。将8只孕鼠随机分为对照组与早产组，每组4只。 早产组大鼠在妊娠第18日皮下注射米非司酮10 mg/kg，建立米非司酮诱导的早产大鼠模型，对照组大鼠在相同时间注射芝麻油，分别于注射后6 h及24 h采集2组大鼠外周血，检测血清中IL-17、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平。比较早产组和对照组间IL-17、GM-CSF水平的差异。结果早产组大鼠在妊娠第18日皮下注射米非司酮后的发动分娩时间间隔明显短于皮下注射芝麻油的对照组(P<0.01)。早产组大鼠在注射米非司酮后6 h时血清IL-17水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，24 h时血清IL-17水平高于对照组(P<0.01)。2组大鼠在注射米非司酮后6、24 h时血清GM-CSF水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论米非司酮诱导的早产大鼠外周血中IL-17水平升高，提示炎症因子IL-17可能参与了激素诱导的早产发生过程。

米非司酮；白介素-17；早产；大鼠

我国将早产定义为自末次月经第1日开始在孕28周至不满37周间终止妊娠者，其发病率为5%～15%[1]。尽管围生医学水平在不断提高，早产仍为导致新生儿死亡和患病的首要原因。早产与激素、感染、免疫、遗传及环境等多种因素相关[2]。虽然其确切的发病机制尚未阐明，但有研究提示炎症因素在早产的发生中起重要作用。有研究报道，炎症因子IL-17在感染引起的早产病例中显著增加，然而IL-17是否参与促进激素诱导的早产发生目前未见报道[3]。本研究通过建立米非司酮诱导的早产大鼠模型，对比IL-17在早产组和对照组外周血中水平的差异，探讨炎症因子IL-17可能在激素诱导的早产中的作用。

材料与方法

一、实验动物

SPF级Sprague-Dawley大鼠(10～12周龄，200～400 g)，购于广东省实验动物中心，自由摄食及饮水，光照时间为上午6点至下午6点，室温23～26 ℃，相对湿度30%～80%，定期紫外线消毒，通风良好。本研究经广州医科大学伦理委员会批准。

二、方法

1. 动物模型的建立

参照Garfield等[4]的方法建立动物模型：经过隔离检疫并适应性喂养1周后按雌雄小鼠4∶1合笼，次晨行阴道涂片，镜检发现精子者标记为妊娠第1日。将8只孕鼠按随机数字表法分为对照组与早产组，每组4只。在妊娠第18日，早产组予经皮下注射米非司酮10 mg/kg(预溶于0.3 ml芝麻油)；对照组大鼠在相同时间点注射等体积的芝麻油。

2. 外周血IL-17、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)水平的检测

SD大鼠在妊娠第18日经皮下注射米非司酮或芝麻油6 h和24 h后，分别从眼眶取血约0.5 ml，离心后取上层血清，采用液相芯片法(eBioscience)检测血清中IL-17、GM-CSF的水平。测定完全按照试剂盒说明书进行：准备相应的标准品S1-S8及检测样品；预混抗体微球并加入96孔板，每孔50 μl，洗涤孔板2次；加入25 μl 分析缓冲液至96孔板，然后加入25 μl 标准品及25 μl 血清样本至对应含抗体微球的96孔板中，封板膜密封孔板，避光室温500 rpm振荡孵育2 h；洗涤孔板3次，稀释探测抗体并向每孔加入25 μl，封板膜密封孔板，避光室温500 转/分振荡孵育30 min；洗涤孔板3次，每孔加入50 μl SA-PE溶液，封板膜密封孔板，避光室温500转/分振荡孵育30 min；洗涤孔板3次，加入120 μl 上机液重悬微球，500转/分震荡5 min后上机读数，根据标准曲线计算出样本中IL-17及GM-CSF的水平。

三、统计学处理

结　　果

一、早产组与对照组大鼠分娩发动时间间隔比较

2组大鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)，早产组大鼠在妊娠第18日皮下注射米非司酮后的发动分娩时间间隔短于皮下注射芝麻油的对照组(P<0.01)，见表1。2组大鼠均无发生其他并发症。

表1 早产组与对照组大鼠体质量、

二、早产组与对照组大鼠的血清IL-17、GM-CSF水平比较

早产组大鼠在皮下注射后6 h与24 h的血清IL-17水平比较差异有统计学意义(P<0.01)，2个时间点间血清GM-CSF水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。皮下注射后6 h，早产组大鼠在血清IL-17水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；皮下注射后24 h，早产组大鼠血清IL-17水平高于对照组(P<0.01)；早产组大鼠在皮下注射后6 h与24 h的血清GM-CSF水平与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表2及图1。

表2 早产组与对照组大鼠血清IL-17、GM-CSF水平比较　ng/L

图1　早产组与对照组大鼠血清IL-17、GM-CSF水平变化及比较

A：血清IL-17水平，*P<0.01；B：GM-CSF水平

讨　　论

在全球范围内，早产的发病率达5%～18%，每年有上百万的新生儿死于早产相关的并发症，早产是导致围生儿患病和死亡的最常见原因[5]。目前已知的早产高危因素包括下生殖道感染、胎膜早破、子宫膨胀过度及妊娠合并症等。然而，越来越多的研究表明，无论是否存在感染，炎症反应在早产的发病中均起着至关重要的作用[2]。

早产是一个由免疫系统与神经系统、内分泌系统共同参与的过程。在此过程中，炎症细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞和其他淋巴细胞集聚在母胎界面，产生大量的细胞因子及趋化因子，进而募集更多的炎症细胞并促使前列腺素和蛋白酶水平增高，引起子宫收缩、宫颈成熟扩张及胎膜早破[2]。

IL-17作为一种重要的炎性介质，主要由辅助性T细胞17(Th17)细胞、γδ T 细胞及自然杀伤 细胞等多种固有免疫细胞产生。IL-17能诱导多种炎症细胞因子、急性期反应蛋白和趋化因子MCP-1、MIP-2等表达，促进嗜中性粒细胞的增殖、成熟和趋化，还能上调组织细胞黏附分子-1的表达，介导炎症细胞和T 细胞在组织中的浸润，并与其他炎症细胞因子发挥协同效应，促进T 细胞的活化并协助B 细胞产生抗体，放大靶器官的免疫反应及炎症性破坏，从而参与多种感染、自身免疫性疾病的发病[6-7]。

多项研究结果提示，IL-17在复发性流产的发生中起重要作用[8-10]。但其与早产的关系鲜见报道。Fu等[10]报道了IL-17在感染性早产中具有进一步诱导炎症的作用，然而对其是否在激素诱导的早产中起作用笔者尚未见报道。故本研究选择米非司酮诱导的早产大鼠模型，比较其与正常妊娠大鼠外周血中IL-17、GM-CSF的水平。结果发现，早产组大鼠在皮下注射米非司酮 24 h后血清IL-17的水平较6 h时升高；在注射后6 h时，早产组血清IL-17水平与对照组相近，24 h 时早产组血清IL-17水平高于对照组，而GM-CSF在2组间比较差异均无统计学意义。结果提示，炎症因子IL-17可能参与促进了激素诱导的早产的发生，然而升高的IL-17主要由哪种细胞产生及其具体分子作用机制尚有待进一步的探讨。本研究也从另一角度说明早产是多种因素(包括激素、炎症因子等)相互作用的过程，而多学科人员的共同努力将为早产的防治提供新的思路及选择。

[1]中华医学会妇产科学分会产科学组. 早产临床诊断与治疗指南(2014).中华围产医学杂志，2015，18(4)：241-245.

[2]Romero R, Dey SK, Fisher SJ.Preterm labor: one syndrome, many causes.Science,2014,345(6198):760-765.

[3]Ito M, Nakashima A, Hidaka T, Okabe M, Bac ND, Ina S, Yoneda S, Shiozaki A, Sumi S, Tsuneyama K, Nikaido T, Saito S.A role for IL-17 in induction of an inflammation at the fetomaternal interface in preterm labour.J Reprod Immunol,2010,84(1):75-85.

[4]Garfield RE, Gasc JM, Baulieu EE.Effects of the antiprogesterone RU 486 on preterm birth in the rat.Am J Obstet Gynecol,1987,157(5):1281-1285.

[5]Howson CP, Kinney MV, McDougall L, Lawn JE; Born Too Soon Preterm Birth Action Group.Born too soon: preterm birth matters.Reprod Health,2013,10(Suppl 1):S1.

[6]Korn T, Bettelli E, Oukka M, Kuchroo VK.IL-17 and Th17 Cells.Annu Rev Immunol,2009,27:485-517.

[7]黄雪琼，檀卫平，王东烨，麦贤弟，吴葆菁，李静，蓝丹. 哮喘患儿外周血RORC mRNA、IL-17水平及其与气道重塑的关系研究.新医学，2014，45(2):104-107.

[8]Nakashima A, Ito M, Shima T, Bac ND, Hidaka T, Saito S.Accumulation of IL-17-positive cells in decidua of inevitable abortion cases.Am J Reprod Immunol,2010,64(1):4-11.

[9]Wang WJ, Hao CF, Yi-Lin, Yin GJ, Bao SH, Qiu LH, Lin QD.Increased prevalence of T helper 17 (Th17) cells in peripheral blood and decidua in unexplained recurrentspontaneous abortion patients.J Reprod Immunol,2010,84(2):164-170.

[10]Fu B, Li X, Sun R, Tong X, Ling B, Tian Z, Wei H.Natural killer cells promote immune tolerance by regulating inflammatory TH17 cells at the humanmaternal-fetal interface.Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(3):E231-E240.

(本文编辑：林燕薇)

Expression and significance of interleukin-17 in the peripheral blood of mifepristone-induced preterm labor rat models

BaoJunjie,YeAihua,QiuXiantao,ShiShaoqing,LiuHuishu.

PretermBirthPreventionandTreatmentResearchUnit,GuangzhouWomenandChildren’sMedicalCenter,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510623,China

Correspondingauthor,LiuHuishu

ObjectiveTo investigate the expression level and significance of interleukin (IL)-17 in the peripheral blood of mifepristone-induced preterm labor rat models. MethodsSpecific pathogen free (SPF)-grade Sprague-Dawley rats, aged 10-12 weeks, were acclimated for 1 week and then the male and female rats were housed and mated. A positive vaginal smear for sperm after mating was designated as gestation day 1 of pregnancy. Eight pregnant rats were randomly divided into control and preterm labor groups (n=4 for each group). In the preterm labor group, mifepristone-induced preterm labor rat models were established by subcutaneous injection of mifepristone at a dose of 10 mg/kg on gestation day 18 of pregnancy. In the control group, rats were injected with vehicle (sesame) on gestation day 18 of pregnancy. At 6 h and 24 h after injection, peripheral blood samples were collected for detection of the serum levels of IL-17 and granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). The serum levels of IL-17 and GM-CSF were statistically compared between two groups. ResultsAfter subcutaneous injection of mifepristone on gestation day 18 of pregnancy, the time interval of labor onset in the preterm labor group was significantly shorter compared with that in the control group (P<0.01). At 6 h after administration of mifepristone, the IL-17 levels did not significantly differ between two groups (P>0.05). At 24 h after administration of mifepristone, the IL-17 level in the preterm labor group was significantly up-regulated than that in the control group(P<0.01). At 6- and 24-h after administration of mifepristone, the GM-CSF levels did not significantly differ between two groups(bothP>0.05). ConclusionThe IL-17 level in the peripheral blood of mifepristone-induced preterm labor rats was significantly up-regulated, suggesting that IL-17, as an inflammatory cytokine, probably participates in the incidence of hormone-induced preterm labor.

Mifepristone; Interleukin-17; Preterm labor; Rat

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.09.003

国家863计划子课题项目(2011AA02A111)；广州市医药卫生科技一般引导项目(20141A010028)

510623 广州，广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心妇产科早产研究室(鲍俊杰，叶爱华，施少清，刘慧姝)，临床检验部(邱先桃)

，刘慧姝

2016-06-05)