常思远　姜 朔　杨倩鹏　史 琳

(清华大学热科学与动力工程教育部重点实验室 CO2资源利用与减排技术北京市重点实验室清华大学热能工程系　北京　100084)



利用苯扎氯铵抑制再生水源热泵系统中微生物污垢的实验研究

常思远姜 朔杨倩鹏史 琳

(清华大学热科学与动力工程教育部重点实验室 CO2资源利用与减排技术北京市重点实验室清华大学热能工程系北京100084)

再生水源热泵系统以城市再生水作为冷热源，为城市建筑制冷、供暖，而微生物污垢是影响再生水源热泵系统效率和安全的重要问题。本研究通过进行挂片实验，利用不同质量分数的杀菌剂苯扎氯铵每天浸泡污垢10 min，考察其抑垢作用。对污垢进行活性染色，并利用共聚焦激光扫描显微镜CLSM对其进行拍照，观察污垢内细胞的活性分布。最后利用Imaris软件分别统计活/死细胞所占的生物体积。结果表明，苯扎氯铵对微生物污垢具有抑制作用，能杀灭污垢内绝大部分细菌细胞，且该作用随其质量分数上升而增强。该研究可对相关抑垢技术提供指导，从而提高再生水源热泵系统的运行效率与系统安全，促进该项技术的实际应用。

再生水源热泵系统；微生物污垢；苯扎氯铵；激光共聚焦扫描显微镜

我国城市污水排放量大，处理率高[1]，处理后产生的城市再生水具有流量大而稳定、温度冬暖夏凉等特点，是理想的热泵冷热源[2- 3]。以城市再生水作为冷热源的再生水源热泵系统是一项立足于节能减排的技术，能够利用再生水中含有的大量低品位热能，实现城市建筑的制冷、供暖，该项技术在实际中已有了一定的应用[4-7]。但在运行过程中发现，由于再生水中含有细菌等杂质，易在热泵系统的板式换热器内形成污垢，严重影响热泵系统的效率与安全性。

本课题组前期研究表明[8]，板式换热器内污垢是以微生物污垢为主体的混合污垢。微生物污垢是指致垢流体中含有的细菌等微生物附着到固体基底表面，并繁殖、生长、产生分泌物而形成的生物粘膜[9-10]。利用杀菌剂清洗能够杀灭流体与污垢中的细菌，促进污垢的剥离脱落，是目前常用的抑垢除垢手段[11]。苯扎氯铵作为一种广谱、高效杀菌剂，能够有效去除微生物污垢，并且对人体与环境没有危害作用[12]。

共聚焦激光扫描显微镜CLSM是医学、生物领域常用的显微检测手段，由于其具有能够分辨细胞活性、不同组分分布等优点，目前在微生物污垢研究领域正受到越来越广泛的应用[13-14]。但目前利用CLSM主要是对污垢内细胞活性分布进行定性观察，还鲜有研究利用软件对CLSM显微照片进行定量统计与分析。

本研究进行挂片实验，通过挂片在人工再生水中的转动在挂片表面生成微生物污垢，并定时将挂片浸泡在不同质量分数的苯扎氯铵溶液中进行除垢。对污垢进行活性荧光染色，并利用CLSM观察污垢内细胞活性分布；利用Imaris软件统计活/死细胞的生物体积，从而定量分析了苯扎氯铵的杀菌与抑垢作用。

1 实验材料与方法

1.1 旋转挂片仪成垢

本研究通过人工配置的方法模拟城市再生水，将实际再生水中的优势菌种芽孢杆菌[15]菌液稀释到盛有一定量过滤水的烧杯之中，使其中菌浓度达到1.0×105CFU/mL，添加葡萄糖使其中BOD达到 15 mg/L，从而与实际再生水的相关参数保持一致。每12 h更新人工再生水，并利用涂平板法对其中活菌浓度进行了监测，发现整个实验周期内菌浓度为(1.0±0.1) ×105CFU/mL，较为稳定。随后将各组盛有人工再生水的烧杯放置到如图1所示的旋转挂片仪(RCCⅢ型)中的恒温水浴部分中，调节水浴温度为实际工况中常见的25 ℃。

图1 旋转挂片仪Fig.1 The rotation coupon instrument

将不锈钢挂片(材质SS316，尺寸20 mm×20 mm×1 mm)固定到挂片仪旋转转轴上，下降升降平台，使挂片沉入烧杯内配制好的人工再生水中。随后旋转转轴匀速转动，带动挂片在人工再生水中做绕轴转动，从而模拟再生水流经换热板片表面并生成微生物污垢这一实际过程。转轴转速为96 r/min，对应线速度0.4 m/s，与工程实际保持一致。

每天定时将挂片取下，分别浸泡到生理盐水(对照组)和质量分数ω分别为10-4，2×10-4，10-3的苯扎氯铵溶液中，浸泡时间为10 min/d。浸泡完毕后再将挂片安装回挂片仪上，在人工再生水中继续成垢，实验共持续5天。

1.2 污垢的活性荧光染色

从成垢第一天至第五天成垢结束，每天从各浸泡组分别取一片挂片进行活性荧光染色。使用的荧光染色剂为LIVE/DEAD® Biofilm Viability Kit(Life Technology，货号L10316)，成分为SYTO® 9 + Propidium Iodide (PI，碘化丙啶)。其中SYTO® 9能够将污垢中所有细菌细胞的核酸染色，并在随后CLSM拍照时受激光激发发出绿色荧光，而PI只能穿过破损的细胞膜，将所有死细胞的核酸染色，并在激光激发下发出红色荧光，覆盖掉绿色荧光，从而完成对污垢内活(绿色)/死(红色)细胞分布的区分。

染色时，首先将3 μL的SYTO® 9与3 μL的PI稀释到1000 μL的去离子水中，配成染色剂，然后每片挂片表面轻轻滴加500 μL该染色剂，避光染色25 min。随后利用去离子水漂洗挂片表面污垢5 min，洗去未与细胞结合的染色剂。染色后的挂片如图2所示。

图2 染色后的挂片Fig.2 The stained coupon

1.3 污垢的CLSM拍照与照片分析

将染色后的污垢放置到CLSM上进行拍照，CLSM工作原理如图3所示。激光发射器发射出的激光经折射照射样品，样品内的荧光染料在激光激发下发出荧光，在针孔的遮挡作用，以及滤片的滤光作用下，只有聚焦平面的荧光能够达到光电倍增管PMT，从而增加了图像的清晰度。PMT将光信号转化为电信号传输至计算机，经成像软件处理形成CLSM显微照片。

图3 CLSM工作原理Fig.3 Operating principle of CLSM

利用Imaris软件(v. 7.2.3，Bitplane)将CLSM二维图片集进行三维重构，得到污垢的立体微观结构；随后利用Imaris软件中“surface”功能，定量统计出三维图片中活/死细胞所占的生物体积。

2 实验结果分析

2.1 污垢内细胞生物体积

为了能够定量考察污垢内细胞的活性分布，利用Imaris软件计算了CLSM显微照片中活/死细胞分别所占的生物体积。在用于定量统计的CLSM拍照中，采用了40倍物镜，从而能够更清晰分辨出单个细胞，进而计算其体积；拍摄中随机选取5个视场，利用软件求出其对应的生物体积后求平均作为最终结果。

成垢5天时间中污垢内活/死细胞所占生物体积如图4所示。

图4 污垢内活/死细胞的生物体积Fig.4 Biovolume of live/dead cell in the biofouling

从图中看出，未进行苯扎氯铵浸泡时，污垢中活细胞占绝大部分比例，活性较强，细胞繁殖生长迅速，污垢内细胞总体积较大，最高可达18236 μm3；而不同质量分数的苯扎氯铵溶液每天浸泡污垢10 min，使得污垢内活细胞所占比例大大减小，死细胞占绝大部分比例，从而污垢活性降低，易于剥离脱落。实验结果表明，苯扎氯铵浸泡对污垢内细菌具有显著的杀灭作用，能够杀死绝大部分细菌。

2.2 污垢内活/死细胞的体积比例

从图4中看出，对照组成垢第5天的细胞总体积小于成垢第4天的细胞总体积，但实际实验中，第5天污垢的宏观质量、体积均大于第4天。产生这一差异的主要原因是第5天污垢厚度较大，CLSM拍照时，污垢内部发射的荧光受顶层细胞遮挡较为严重，底层细胞荧光信息较弱，从而导致统计出的细胞整体体积较小。

针对这一情况，计算了不同质量分数苯扎氯铵溶液浸泡下污垢内活细胞与死细胞体积的比值，所得结果如图5所示。

图5 活细胞与死细胞体积比例Fig.5 The ratio of biovolume of live cell to dead cell

从图中可以看出，对照组中污垢内活细胞体积所占比例远大于死细胞，活细胞体积大概是死细胞体积的101～102倍；而当利用苯扎氯铵每天浸泡10 min后，污垢内死细胞占绝大部分比例，活细胞体积大概是死细胞体积的10-1～10-2倍；此外，随着苯扎氯铵质量分数的逐渐上升，活细胞体积与死细胞体积的比值逐渐减小，当苯扎氯铵质量分数上升至ω=10-3时，5天成垢时间内活细胞与死细胞体积的比值仅为0.0098～0.079。实验结果表明，苯扎氯铵溶液对细菌的杀灭作用随其质量分数的上升而增强。

2.3 细胞活性分布的定性观察

除了利用CLSM显微照片定量统计污垢内活/死细胞所占体积，还通过拍照观察了不同质量分数苯扎氯铵溶液浸泡后污垢内细胞的活性分布。在用于定性观察的CLSM拍照中，选择采用了10倍物镜，其视场范围更大，从而能够获得更全面的活性分布与微观形貌信息。

以成垢第5天的污垢为例，各组污垢的CLSM显微照片如图6所示。

图6 第5天污垢的CLSM照片(A为对照组，B、C、D分别对应苯扎氯铵质量分数10-4，2×10-4，10-3，图中比例尺长度为200 μm)Fig.6 CLSM pictures of biofouling on the fifth day (A: control group; B, C, D: benzalkonium chloride mass fraction was 10-4, 2×10-4, 10-3 scale bar=200 μm)

从图中可以看出，对照组中污垢内几乎全部为活细胞(绿色荧光)，说明正常生长的污垢内部主要含有活细菌细胞；而分别利用质量分数为10-4，2×10-4，10-3的苯扎氯铵每天浸泡污垢10 min后，污垢内活细胞的显著减少，死细胞(红色荧光)几乎遍布整个视场；当苯扎氯铵溶液质量分数上升至10-3时，视场中有明显无污垢覆盖的黑色裸露区域，说明在高质量分数苯扎氯铵溶液处理后，污垢由于内部细胞大量死亡，整体强度下降，变得易于剥离脱落。

有研究表明[16]，当换热器内微生物污垢细胞活性下降，污垢量减少时，能够提高换热器的换热效率，缩短换热器的清理周期，避免污垢带来的堵塞腐蚀等问题。而利用苯扎氯铵进行清洗，能够杀灭污垢内部的细菌，抑制污垢的生长，从而提高再生水源热泵系统的运行效率与系统安全。

3 结论

本研究进行挂片成垢实验，利用不同浓度苯扎氯铵每天浸泡污垢10 min，对污垢进行活性荧光染色及CLSM拍照，并利用Imaris软件定量分析显微图片，从而得出了如下结论：

1)苯扎氯铵对污垢内细菌有明显的杀灭作用，使得其中活细胞所占体积显著降低；

2)苯扎氯铵对细菌的杀灭作用随其质量分数升高而增强，当达到较高质量分数时能够杀灭绝大部分细菌；

3)苯扎氯铵通过杀灭细菌对污垢表现出显著的抑制作用，能够降低污垢的活性与强度，使得污垢易于剥离脱落，从而提高再生水源热泵系统的运行效率与系统安全。

[1]金兆丰, 徐竟成. 城市污水回用技术手册[M].北京:化学工业出版社, 2004: 59-74.

[2]Yang Q, Wilson D I, Chen X, et al. Experimental investigation of interactions between the temperature field and biofouling in a synthetic treated sewage stream[J]. Biofouling, 2013,29(5):513-523.

[3]Funamizu N，Iida M，SakakuraY,et al. Reuse of heat energy in wastewater: implementation examples in Japan[J]. Water Science and Technology, 2001, 43(10): 277-285.

[4]Tian L, Chen X, Yang Q, et al. Effect of calcium ions on the evolution of biofouling by Bacillus subtilis in plate heat exchangers simulating the heat pump system used with treated sewage in the 2008 Olympic Village[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2012, 94(3): 309-316

[5]Wu R H, Sun D X, Zhang C H, et al. Application and progress of urban wastewater as a cool and heat source[J]. Journal of Harbin Institute of Technology, 2006, 38(9): 1326-1329.

[6]高琼, 吴春江, 杨士安. 卢沟桥污水厂二级出水热泵系统的运行经验[J]. 中国给水排水, 2006, 22(20): 57-60. (GAO Qiong, WU Chunjiang, YANG Shi′an. Operation experience of reclaimed water source heat-pump system in lugouqiao municipal wastewater treatment plant[J]. China Water & Wastewater, 2006, 22(20): 57-60.)

[7]周文忠. 污水源热泵空调系统在污水处理厂的应用[J]. 暖通空调, 2005, 35(1): 83-86. (ZHOU Wenzhong. Application of sewage source heat-pump system inmunicipal wastewater treatment plant[J]. Heating Ventilating & Air Conditioning, 2005, 35(1): 83-86.)

[8]田磊, 杨倩鹏, 史琳, 等. 无机颗粒对换热表面微生物污垢形成影响研究[J].工程热物理学报, 2012, 33(10):1767-1770. (TIAN Lei, YANG Qianpeng, SHI Lin, et al. Development of biofouling by bacillus subtilis on heat transfer surfaces in the presence of silica dioxide particles[J]. Journal of Engineering Thermophysics, 2012, 33(10): 1767-1770.)

[9]Tian L, Chen X, Yang Q, et al. Effect of silica dioxide on the evolution of biofouling by Bacillus subtilis in plate heat exchangers relevant to a heat pump system used with treated sewage[J]. Chemical Engineering Journal, 2012, 188(1): 47-56.

[10] Wang F. Pollutant removal and membrane fouling in an anaerobic submerged membrane bioreactor for real sewage treatment[J]. Water Science & Technology, 2014, 69(8):1712-1719.

[11] Zhang M，Zhang K，Gusseme B D，et al. The antibacterial and anti-biofouling performance of biogenic silver nanoparticles by Lactobacillus fermentum[J]. Biofouling, 2014, 30(3):347-357.

[12] Beveridge C M. The effect of benzalkonium chloride concentration on nine marine diatom species[J].Environmental Pollution, 1998, 103(1): 31-36

[13] Agarwal A，Ng W J，Liu Y. Cleaning of biologically fouled membranes with microbubbles[J]. Biofouling, 2013, 29(1):69-76.

[14] Hwang G. Analysis of the mechanical stability and surface detachment of mature Streptococcus mutans biofilms by applying a range of external shear forces[J]. Biofouling, 2014, 30(9):1079-1091.

[15] 杨倩鹏, 陈晓东, 田磊, 等. 不同营养下混合菌种微生物污垢生长机理与交互作用[J].化工学报, 2013, 64(3):1036-1041. (YANG Qianpeng, CHEN Xiaodong, TIAN Lei, et al. Growth and interaction mechanism of multi-strain biofouling under different nutrient level[J].CIESC Journal, 2013, 64(3):1036-1041.)

[16] 杨倩鹏, 田磊, 常思远, 等. 换热表面镀银抑制微生物污垢综合分析[J].工程热物理学报, 2014, 35(2): 354-357. (YANG Qianpeng, TIAN Lei, CHANG Siyuan, et al. Comprehensive analysis of the effect of silver-coated heat-exchange surface on biofouling inhibition[J]. Journal of Engineering Thermophysics, 2014, 35(2):354-357.)

About the author

Chang Siyuan, male, Ph. D. candidate, Department of Thermal Engineering, Tsinghua University,+86 10-62794535, E-mail：changsiyuan1226@163.com. Research fields: Biofouling inhibition in treated sewage heat pump systems. The author participates in project “Study on Growth and Inhibition Mechanisms and Heat Transfer Characteristics of Biofouling” supported by National Natural Science Foundation of China.

Experimental Investigation on the Anti-fouling Effect of Benzalkonium Chloride against Biofouling in Treated Sewage Heat Pump System

Chang SiyuanJiang ShuoYang QianpengShi Lin

(Key Laboratory for Thermal Science and Power Engineering of Ministry of Education, Beijing Municipal Key Laboratory for CO2Utilization & Reduction, Department of Thermal Engineering of Tsinghua University, Beijing, 100084,China)

The treated sewage heat pump system reuses the wasted heat in the city sewage to cool and/or heat the buildings. Biofouling, as the key problem in treated sewage heat pump systems, decreases the system efficiency and security. In this study, rotary coupon experiments were conducted, and Benzalkonium chloride, a broad-spectrum and efficient bactericide, of various concentrations was used to immerse the biofouling 10 min per day. Vital dye was used to stain the biofouling and confocal laser scanning microscope (CLSM) was used to take microphotographs of the biofouling to show the viability distribution of the bacteria cells in the biofouling. Imaris was used to calculate the biovolume of live/dead cells. The results show that benzalkonium chloride inhibits the biofouling significantly by killing most of the bacteria cells, and the inhibition effect is enhanced as the concentration increases. This research obtains insight into the biofouling inhibiting techniques and promotes the practical application of the treated sewage heat pump system by increasing the system efficiency and security.

treated sewage heat pump system； biofouling； benzalkonium chloride； confocal laser scanning microscope

0253- 4339(2016) 04- 0015- 05

10.3969/j.issn.0253- 4339.2016.04.015

国家自然科学基金 (51476090, 50976060)和国家创新团队 (51321002) 资助项目。(The project was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 51476090 and No. 50976060) and the Science Fund for Creative Research Group (No. 51321002).)

2015年12月30日

TK124;TQ051.5

文献识别码：A

常思远，男，博士生，清华大学热能工程系工程热物理研究所， (010)62794535，E-mail:changsiyuan1226@163.com。研究方向：再生水源热泵中微生物污垢抑制的研究。参与的研究项目有：国家自然科学基金“多物理场下微生物污垢的生长与抑制机理及传热特性研究”。