陈洁　温正旺　陈晓晴　金龙腾　陈益平　李昌崇

TLR3-NEMO-NFkβ信号通路对手足口病脑炎的诊疗价值

陈洁温正旺陈晓晴金龙腾陈益平★李昌崇

目的 探讨干扰素TLR3-NEMO-NFkβ信号通路在EV71手足口病脑炎重症重型中的诊疗价值。方法 选取2014年1月至2015年1月通过脑脊液检查及临床诊断的儿童144例分成普通手足口病儿童2d 组（A组）、普通手足口病儿童5d组（B组）、手足口病脑炎重症重型2d组（C组）、手足口病脑炎重症重型5d组（D组），每组各36例。另选择同期健康体检儿童36例为对照组。用ELISA法检测各组血液中TLR3、NEMO、NFkβ蛋白及干扰素的表达水平。结果 观察组干扰素的表达水平明显高于对照组（P＜0.01），A组、C组和D组间差异无统计学意义（P＞0.05），B组明显高于A组、C组和D组（P＜0.01）。观察组TLR3、NEMO、NFkβ蛋白的表达水平明显高于对照组（P＜0.01），A组、C组和D组间差异无统计学意义（P＞0.05），B组明显高于A组、C组和D组（P＜0.01）。结论 手足口病脑炎患儿干扰素及TLR3、NEMO、NFkβ蛋白的表达水平会较正常儿童明显升高，但相较于普通手足口病患儿会较低，提示TLR3-NEMO-NFkβ信号通路对手足口病脑炎具有一定的诊断意义。

EV71 手足口病 脑炎 干扰素

手足口病（hand，food and mouth disease）是一种严重的传染性疾病，多发于学龄前儿童，自2007年来，世界各国手足口病重症病例及手足口病脑炎的报道出现明显上升，甚至出现死亡病例，国内手足口病脑炎的诊断及治疗也面临着重要的考验［1-2］，本课题将干扰素的应答机制作为切入点，通过检测手足口病患儿2d、5d组和手足口病脑炎患儿2d、5d组以及正常体检儿童对照组血中TLR3、NEMO、NFkβ信号通路蛋白、基因及干扰素的表达水平，从分子生物学机制上研究干扰素的应答信号通路对EV71手足口病脑炎的影响，为临床中手足口病脑炎的及时诊疗及研究提供一个新的靶点。

1　临床资料

1.1一般资料 选择2014年1月至2015年1月本院手足口病患儿144例为观察组，其中男72例，女72例，年龄6个月至3岁。均经脑脊液、粪便EV71抗原检查及临床表现确诊，重症重型多表现为持续发热＞3d，偶有肢体抖动，睡觉时有惊跳，精神软，排除合并其它疾病。依据病情及时间分成4组，普通手足口病患儿2d组（A组）、5d组（B组）；手足口病脑炎重症重型患儿2d组（C组）、5d组（D组），每组各36例。另选择同期健康体检儿童36例为对照组，男18例，女18例，年龄6个月至3岁。各组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法 采用Elisa法检测各组中TLR3、NEMO、NFkβ及干扰素的蛋白表达（试剂盒由博士得公司提供），在每日清晨抽取各组的外周静脉血1.5 ml，共5组，加入 24孔培养板中，加入血40μl/孔，第1 孔加入生理盐水作为基础对照，第2、3、4、5、6 孔作阳性对照，加入植物血凝素（PHA）100μl，后5孔者分别用生理盐水稀释成 50g/ml，加入总量均为200μl，加入抗原后轻柔摇动20s，37 ℃水浴中孵育16～20h，抽取血浆上清液适量，于-20℃冰箱冷冻备用，根据标准品的浓度及对应的光密度（OD）值计算标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。干扰素的释放水平检测严格按照试剂盒说明书操作。

1.3统计学方法 采用SPSS12.0统计软件。正态计量资料以（x±s）表示，正态分布资料采用one-way ANOVA方差分析，组间比较方差齐采用LSD检验，方差不齐则采用Tamhane's T2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组干扰素的表达水平比较 观察组干扰素的表达水平明显高于对照组（P＜0.01），A组、C组和D组间差异无统计学意义（P＞0.05），B组明显高于A组、C组和D组（P＜0.01）。。

2.2各组TLR3、NEMO、NFkβ蛋白的表达水平比较 观察组TLR3、NEMO、NFkβ蛋白的表达水平明显高于对照组（P＜0.01），A组、C组和D组间差异无统计学意义（P＞0.05），B组明显高于A组、C组和D组（P＜0.01）。见表1。

表1　各组TLR3、NEMO、NFkβ蛋白的表达水平比较［μg/ml，（x±s）］

2.3预后 本实验中涉及的重症重型病例手足口病脑炎患儿经过积极治疗后，病情基本稳定，在住院12～14d后治愈出院，未出现转为危重型的病例。

3　讨论

目前EV71病毒的检测及EV71病毒感染的治疗存在滞后性及缺乏针对性，EV71病毒感染所致手足口病脑炎可导致脑干脑炎以及严重的神经系统损伤。EV71手足口病脑炎的研究，一直是世界各国研究的难点和热点，我国一直有对手足口病脑炎患者进行粪便采集及EV71检测，但对于EV71如何导致手足口病脑炎的分子机制仍研究甚少，目前研究发现干扰素可以影响EV71手足口病脑炎的进展及预后，但起效机制尚未明确，本课题将干扰素的产生机制作为切入点，从分子生物学机制上研究干扰素的产生信号通路对EV71手足口病脑炎的影响，为手足口病脑炎的及时诊疗及研究提供一个新的靶点。

EV71病毒属于小RNA病毒科、肠道病毒属病毒，为单股正链RNA病毒［3］。自1974年首次报道从美国加州神经系统疾病患者标本中分离得到EV71以来，EV71病毒曾在世界范围内多次引起暴发疫情，主要引起婴幼儿手足口病和无菌性脑膜炎、脑炎等多种严重的神经系统疾病，以及心肌炎、肺水肿等。有研究提示用EV71病毒感染神经细胞可以导致神经细胞的损伤，说明EV71攻击性较强，在新生小鼠体内如何导致神经系统的损伤，其病理生理机制尚未明确，但提示这些损伤均需依赖于一些未知的内部因子［4］。

干扰素是一类高活性多功能的糖蛋白，能诱导细胞对病毒感染产生抗性，其通过干扰病毒基因转录或病毒蛋白组分的翻译，从而阻止或限制病毒感染，是目前最主要的抗病毒感染和抗肿瘤生物制品［5］。其抗病毒活性不是杀灭而是抑制病毒，作为广谱病毒抑制剂，对RNA和DNA病毒均有抑制作用，当病毒感染恢复期可见干扰素的存在。IFN-Ⅰ中α、β和IFN-Ⅱ具有较强的抗病毒、抗肿瘤活性并且在病毒感染引起的免疫应答中起重要的调节作用，长期作为有效的抗病毒与抗肿瘤药物应用于临床［6］。对其抗病毒、抗肿瘤机制的研究，一直是病毒学研究的热点。在临床治疗中使用干扰素制剂可以对EV71手足口病脑炎的症状起到控制作用［7］。

干扰素存在应答及产生信号通路，主要通过产生信号通路发挥作用。在干扰素产生信号通路的上游，存在一种TLR3 受体，其是toll 样受体中的一员，是一种重要的模式识别受体，在天然免疫中发挥着核心作用，在诱导获得免疫中也具有重要作用，与病毒感染密切相关；在抗病毒及自身免疫反应中发挥着重要作用［8］。TLR3是病毒dsRNA识别受体，由于dsRNA是病毒复制过程中普遍存在的产物，因此 TLR3在宿主抗病毒天然免疫反应中发挥重要作用［9］。TLR3是干扰素产生信号通路上的一个重要应激因子，多数病毒感染均涉及TLR3的表达，包括EV71病毒，其在多种细胞中广泛表达［10］；尤其在神经突触细胞中表达最为丰富，主要功能是识别病毒感染并诱导干扰素的产生，作为干扰素产生信号通路的上游因子，TLR3可以影响下游信号因子的表达。

TLR3可以通过两种途径产生干扰素，介导病毒感染对机体的影响。其中与NEMO基因相关，涉及DsDNA的途径最为重要。在疱疹病毒导致的脑炎研究中发现，TLR3-UNC-93B信号通路表达的减弱会诱导乃至加重单纯疱疹病毒脑炎［11］。UNC-93B与NEMO之间存在紧密联系，NEMO是一种重要的细胞因子，可以调控 TLR3的活性；TLR3通过NF-Kb介导了单纯疱疹病毒脑炎中的免疫反应，NEMO与IKK（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKβ激酶）结合后参与并诱发了这个发生过程，在研究中TLR3蛋白表达下降，对UNC-98B、NF-Kb的激活产生了抑制作用，最终导致干扰素表达水平下降［12］。本研究结果提示在EV71手足口病及并发脑炎的患儿中TLR3-UNC-93B通路的表达水平明显升高，存在时间依赖性，但在手足口病脑炎患儿中，该通路的表达水平并未随着发病时间的延长而升高，提示EV71病毒感染对该通路具有抑制作用，与先前的研究保持一致，提示TLR3-UNC-93B通路参与EV71手足口病脑炎的发生发展过程。

综上所述，作者推测干扰素“TLR3-UNC-93B”信号通路可能在EV71中枢神经系统损伤中发挥重要作用且具有一定的诊疗意义。但本课题由于时间及客观因素并未收集到危重型手足口病脑炎病例，不能对该通路与与危重型脑炎病例病情的发生发展进行相关性分析，再者，不能设置通路抑制剂组进行比较，无法全面了解该信号通路在手足口病脑炎中的作用，有待通过动物实验来进一步验证。

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Objective To investigate the role of TLR3-NEMO-NFkβ signal pathway in EV71-induced encephalitis of hand foot and mouth disease. Methods The study was conducted at second Affi liated Hospital and Yuying Children Hospital of Wenzhou Medical College from January 2014 to January 2015，based on blood examination，CSF routine test and clinical manifestation. There were 180 members and divided into fi ve groups，each group includes 36. 2day control group，2day hand-food-mouth（A），5day hand-food-mouth（B），2day hand-food-mouth and encephalitis（C），5day hand-food-mouth and encephalitis（D）. Elisa and western blot were used to detect the expressions of certain signal pathway related proteins in blood. Results Elisa assay： the levels of interferon，TLR3，NEMO，NFkβ protein expression in the groups of patients were signifi cantly increased than that of the corresponding control groups（P＜0.01），especially the B group，there was no signifi cant difference found between C group and A group，it was the same between C and D group. Conclusions The levels of the levels of interferon，TLR3，NEMO，NFkβprotein expression in the groups of hand food mouth disease and encephalitis were signifi cant increased，but less expression than that groups of general hand food mouth disease，these suggest that TLR3-NEMO-NFkβ signal pathway has a great role in the diagnosis of hand food mouth disease and encephalitis.

EV71 Hand-food-mouth disease Encephalitis Interferon

浙江省温州市科技计划项目（Y20150375）

325000 温州医科大学附属第二医院