王卓然　王春梅　王杰　李庆章　高学军

摘 要：该研究以泌乳中期的奶牛乳腺上皮细胞为模型，探索Pten基因的表达与奶牛乳腺发育和泌乳之间的关系，目的在于揭示Pten基因在奶牛乳腺中的调节作用，为动物乳腺发育和泌乳调节机制的研究提供基础资料。该研究以中国荷斯坦奶牛作为实验动物，应用荧光定量qRT-PCR、Westernblotting和免疫组织化学技术，对奶牛不同发育阶段及不同乳品质的乳腺组织中Pten mRNA和蛋白质的相对表达量进行检测；以体外培养的泌乳中期奶牛乳腺上皮细胞为研究对象，构建重组质粒pGCMV-Pten-IRES-EGFP，对细胞进行瞬时转染，进行Pten基因过表达实验；应用RNA干扰的方法用Pten siRNA瞬时转染细胞，进行Pten基因抑制实验。分别用相关试剂盒检测Pten基因过表达和抑制之后细胞？-酪蛋白、甘油三酯以及乳糖分泌的情况，为了检测Pten基因对奶牛乳腺上皮细胞活力和增殖能力的影响，分别应用CASY-TT细胞分析仪和流式细胞仪检测细胞活性和细胞周期，采用荧光定量qRT-PCR和Western blotting技术，在mRNA和蛋白水平检测与泌乳相关的信号通路基因的表达变化；同时，添加外源性催乳素和葡萄糖培养细胞，检测培养液上清中？-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的浓度，以及Pten基因的表达量变化，从而探索Pten基因在催乳素诱导的葡萄糖转化生成乳糖过程中的作用。研究结果表明，泌乳期Pten基因表达量显著低于干乳期。与泌乳期低乳品质奶牛乳腺相比，泌乳期高乳品质的奶牛乳腺组织中Pten mRNA和蛋白表达水平分别降低了30%和40%；Pten基因过表达可抑制奶牛乳腺上皮细胞的活力、增殖能力以及？……