杨保军　张丽平　杨晓刚　刘文利　韩文华　杨海平

河北工程大学附属医院心胸外科，邯郸056002

MMP-2与TIMP-1在食管鳞癌细胞中的表达及临床意义

杨保军#张丽平杨晓刚刘文利韩文华杨海平

河北工程大学附属医院心胸外科，邯郸056002

目的检测食管鳞癌（ESCC）及癌旁正常组织中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）以及组织抑制因子（TIMP-1）的表达，研究其与临床特征的关系，为临床ESCC恶性程度和预后判断提供新的依据。方法应用组织芯片技术及免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法（S-P法）对60例ESCC组织及癌旁正常食管组织中MMP-2、TIMP-1蛋白表达进行检测，分析其阳性表达与性别、年龄、组织学分级、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期之间的关系。结果MMP-2、TIMP-1在癌旁正常上皮组织不表达；MMP-2主要在癌细胞中表达，TIMP-1主要在间质细胞中表达，二者在食管鳞状细胞癌中表达阳性率分别为38.3%和46.7%，高于正常组织（P＜0.05）。MMP-2与ESCC的浸润深度、淋巴结转移和TNM临床分期有关，差异有统计学意义（P＜0.05），肿瘤浸润程度深者MMP-2阳性表达率高；无淋巴结转移者的MMP-2阳性表达率低于有淋巴结转移者；临床病理分期为Ⅰ、Ⅱ期患者的阳性表达率低于Ⅲ期者。TIMP-1的表达与ESCC性别、年龄、组织学分级、浸润深度、淋巴结转移及临床病理分期无关（P＞0.05）。结论MMP-2能在ESCC的侵袭、转移中起重要作用，TIMP-1可能与早期ESCC的生物学性状有关，MMP-2与浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关，二者有助于判断ESCC的生物学行为。

食管鳞癌；金属蛋白酶-2；组织金属蛋白酶抑制因子-1；组织芯片；免疫组化

Oncol Prog，2016，14（6）

基底膜及细胞外基质的降解在恶性肿瘤的组织浸润及转移过程中起到关键的作用。基质金属蛋白酶（matrix metal loproteinases，MMP）是降解细胞外基质和基底膜的重要酶类，组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP）为MMP的天然抑制剂，对其功能有重要的调节作用。本研究通过观察食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中MMP-2与TIMP-1的表达及其与ESCC各生物学性状间的关系，以及二者表达之间的相关性，以确定癌组织中MMP及TIMP的表达水平作为判断ESCC侵袭转移性及评价其预后的指标的意义。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取河北工程大学附属医院胸外科1994年1月至2003年12月60例手术患者并通过病理检查已确诊为ESCC的组织蜡块。所有患者都有完整的资料，患者手术之前未进行放疗和化疗。其中，男性38例，女性22例；年龄42～77岁，＞60岁20例，50～60岁30例，＜50岁10例；病理学类型均为鳞状细胞癌；组织学分级：Ⅰ级22例，Ⅱ级28例，Ⅲ级10例；肿瘤浸润至外膜33例，肌层18例（深肌层13例，浅肌层5例），黏膜下层9例；有淋巴结转移29例，无淋巴结转移31例；P-TNM分期：0～Ⅰ期5例，Ⅱ期29例（Ⅱa期17例，Ⅱb期12例），Ⅲ期26例。选取相应的鳞癌组织、食管正常组织（距癌灶5～7 cm的食管上切端标本）石蜡包埋组织块，组织切片，行免疫组化检测。

1.2免疫组化方法

MMP-2与TIMP-1抗体、APES试剂盒和DAB显色剂均为北京中山生物技术有限公司生产，采用同济医科大学千屏影像工程公司提供的彩色病理图文分析系统，组织芯片制作仪为朝阳恒泰科技发展有限责任公司生产。应用组织芯片制作技术制备42（6×7）点列阵的组织芯片，60例食管鳞癌患者共制成240例组织标本。免疫组化染色方法（S-P法）严格按试剂盒说明书进行。TIMP-1、MMP-2蛋白在细胞质中表达，随机观察每例切片20个高倍视野（×200），每个视野中细胞质为棕色的细胞数＜20%为阴性（-），＞20%为阳性（+）。

1.3统计学方法

采用SPSS13.0统计学软件对数据进行处理，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1MMP-2及TIMP-1的表达及分布

60例患者癌旁正常食管黏膜组织中TIMP-1、MMP-2表达均为阴性，60例患者食管癌组织中MMP-2、TIMP-1阳性表达率分别为38.3%（23/60）和46.7%（28/60），二者在癌组织中的表达率均高于正常组织（P＜0.05）。MMP-2主要在食管癌细胞质中表达，为棕黄色的细颗粒状，较少的间质纤维母细胞及组织细胞也呈阳性表达；TIMP-1阳性表达主要在血管内皮细胞、组织细胞和间质纤维母细胞。（图1）

2.2MMP-2及TIMP-1表达与食管鳞癌临床特征的关系

60例患者食管癌组织中MMP-2蛋白表达与ESCC患者组织学分级、年龄及性别无关（P＞ 0.05）；与浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关（P＜0.05）。肿瘤浸润程度深者，MMP-2的阳性表达率高，差异有统计学意义（χ2=8.232，P=0.016）；无淋巴结转移者的MMP-2阳性表达率低于有淋巴结转移者，差异具有统计学意义（χ2=4.258，P=0.039）；临床病理分期为Ⅰ、Ⅱ期的患者阳性表达率明显低于Ⅲ期者（χ2=11.386，P=0.003）。TIMP-1的表达与ESCC患者性别、年龄、组织学分级、浸润深度、淋巴结转移及临床病理分期均无关（P＞0.05）。（表1）

图1　MMP-2及TIMP-1在食管鳞癌组织中的表达（×400）

表1　MMP-2及TIMP-1蛋白表达与食管鳞癌临床特征的关系（n=60）

3　讨论

在恶性肿瘤的侵袭与转移过程中，基底膜和细胞外基质降解是重要环节，肿瘤细胞只有在脱离原发灶，突破基底膜与细胞外基质组成的防线后才能向周围组织侵袭或通过血液、淋巴转移至其他脏器［1］。MMP-2又称Ⅳ型胶原酶或明胶酶，由肿瘤细胞和间质细胞分泌，经水解后激活。大量研究结果表明，MMP-2可降解细胞外基质所有成分和血管基底膜，促进肿瘤侵袭和转移［2］。Samantaray等［3］认为，食管鳞癌中MMP-2高表达与食管肿瘤基因有关，可能为食管癌发生的早期标志。本实验结果表明，60例癌旁正常食管黏膜组织MMP-2均呈阴性表达而食管鳞癌组织MMP-2阳性表达率为38.3%。MMP-2主要是在食管癌细胞质中表达，呈现棕黄色的细颗粒状；较少的组织细胞与间质纤维母细胞也是阳性表达，说明MMP-2参与了食管鳞癌的发生发展过程。在岳庆峰等［4］的研究中，MMP-2的表达程度与有无淋巴结转移、3年生存率、食管鳞癌浸润深度和临床分期有着密切的关系，与本研究结果相近。

TIMP对MMP的活性有抑制作用，两者之间有活性程度和表达量的平衡状态。TIMP-1可以和无活性胶原酶B合成可逆性的复合物，从而对MMP的活性进行抑制。TIMP-1表达上调能够对MMP的产生和活性发挥抑制作用，从而明显减少细胞外基质的降解，起到抑制肿瘤转移、侵袭的作用［5］。本研究结果显示，食管癌组织TIMP-1阳性表达率为46.7%（28/60），明显高于癌旁正常组织。TIMP-1阳性的表达主要是在血管内皮细胞、组织细胞和间质纤维母细胞，提示食管鳞癌患者MMP-2过表达，将其与TIMP-1之间平衡状态打破，使癌细胞转移，降解基底膜，TIMP-1高表达是阻止MMP-2降解细胞外基质的反馈性表达。检测发现，虽然在无淋巴结转移患者食管癌组织中的TIMP-1表达率比有淋巴结转移者低，但经统计学处理无明显的差异，TIMP-1表达与食管鳞癌的其他临床特征也无明显关系，与其他学者的研究结果不同［6］，其原因可能与TIMP-1主要参与食管癌发生的早期过程［7］，而本组样本中早期食管癌数量较少有关，且与不同的研究方法有一定的关系。

60例食管鳞癌患者共制成240例组织标本，一张组织芯片中可容纳样本40多个，排列较整齐，外形类圆形或者圆形，有较少的掉片或者皱折现象，极大地节约了研究经费和降低了劳动量，在最短的时间里获得了食管鳞癌和癌旁正常组织MMP-2、TIMP-1蛋白表达的所有数据，并且在一个平行水平上进行实验操作，最大程度上减低实验误差，使结果更加可信、严谨。和传统病理学技术方法进行比较，组织芯片技术有方便、准确、快速及经济的优点，可用组织芯片对临床组织样本进行大规模、高效的检测。

总之，食管癌的发生、发展是个多基因、多步骤的反应过程，关于MMP-2蛋白与TIMP-1蛋白表达之间的关系，尚待大样本、前瞻性、多中心的中和性研究。本研究结果表明，检测MMP-2、TIMP-1有助于判断食管鳞癌的临床分期、浸润深度、转移潜能，是预测食管鳞癌患者预后的指标。

［1］孙晓宏，庞作良，罗洞波.MMP-2及MMP-7在食管癌及癌旁组织中的表达［J］.山东大学学报（医学版），2010，48（7）: 102-104.

［2］杨昀，蒋永来.基质金属蛋白酶与大肠癌侵袭和转移关系的研究进展［J］.医学研究生学报，2010，23（7）:771-773.

［3］Samantaray S，Sharma R，Chattopadhyaya TK，et al.Increased expression of MMP-2 and MMP-9 in esophageal squamous cell carcinoma［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2004，130（1）:37-44.

［4］岳庆峰，向明，李方明，等.食管癌组织DcR3、MMP-2表达及其对生存率的影响［J］.中国癌症杂志，2010，20（10）: 745-750.

［5］吴晓英，陈卫昌，沈玉玲，等.MMP-1和TIMP-1在人胃癌组织中的表达及临床意义［J］.江苏医药，2008，34（12）: 1200-1202.

［6］王晓兰，李晓莉，陈奎生.MMP-9与TIMP-1蛋白在食管鳞癌中的表达及其与肿瘤浸润、转移的关系［J］.医药论坛杂志，2009，30（8）:1-3.

［7］王洪江，李卉，庞作良，等.TIMP-1在哈萨克族食管癌组织中的表达及其意义［J］.山东医药，2011，51（13）:1-3.

Expressions and clinical significance of MMP-2 and TIMP-1 in esophageal squamous cell carcinoma

YANG Bao-jun#ZHANG Li-ping YANG Xiao-gang LIU Wen-li HAN Wen-hua YANG Hai-ping
Department of Cardiothoracic Surgery，the Affiliated Hospital of the Hebei University of Engineering，Handan 056002，Hebei，China

ObjectiveTo investigate the association between the expressions of matrix metallproteinase-2（MMP-2），the tissue inhibitor of matrix metallproteinase-1（TIMP-1）and the biological characters of esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）.MethodThe expressions of MMP-2 and TIMP-1 were determined by immunohistochemical analysis（SP method）with tissue chip technique in 60 cases of ESCC.Statistical analyses were performed to determine the association between positive expressions of MMP-2，TIMP-1 and gender，age，histological stage，tumor invasion and metastasis. ResultThe expressions of MMP-2 and TIMP-1 were not detected in adjacent normal epithelial tissues，while MMP-2 expression was predominantly observed in cancer cells，and TIMP-1 expression was mainly in cytoplasm，with a positive expression rate of 38.3%and 46.7%in ESCC，respectively，both were higher as compared in normal tissues（P＜0.05）. The expression of MMP-2 were correlated with the depth of cancer invasion，lymph node metastasis，and TNM stage（all P＜0.05），patients with deeper invasion，or with metastasis，or with stage III rather than stage I and II had higher expression of MMP-2.While expression of TIMP-1 was not related to gender，age，histological stage，invasion，lymph node metastasis and clinicopathological stage（P＞0.05）.ConclusionThe high expression of MMP-2 may be essential in ESCC invasion and metastasis，while the TIMP-1 may be associated with early ESCC biological characteristics，the expression of MMP-2 was correlated with invasion depth，lymph node metastasis and TNM stage，which will be helpful in predicting the biological behaviors of ESCC.

esophageal squamous cell carcinoma；matrix metalloproteinase-2；tissue inhibitor of matrix metallprotenase-1；tissue chip technique；immunohistochemical analysis

R735.1

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.06.16

2016-04-26）

（corresponding author），邮箱：13552771810@163.com