沈丰，王艳，邹明畅，盛玉青

(镇江市第一人民医院药剂科，江苏 镇江　212002)



棘豆素对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞的作用研究

沈丰，王艳，邹明畅，盛玉青

(镇江市第一人民医院药剂科，江苏 镇江212002)

目的研究棘豆素(2′,4′-dihydroxychalcone,TFC)对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞的作用，并探讨其作用机制。方法CCK-8法检测药物对细胞增殖的影响；Hoechst 33258染色、荧光显微镜观察细胞的形态学变化；流式细胞术分析细胞凋亡率和细胞周期的变化；Western blot检测药物对肿瘤细胞中P27kip1和PTEN蛋白表达的影响。结果TFC能显著抑制PC-3细胞的增殖，细胞呈现凋亡形态学改变，凋亡率明显增加，细胞周期阻滞于G0/G1期。此外，P27kip1和PTEN蛋白表达量明显增加。结论TFC通过诱导PC-3细胞凋亡抑制肿瘤细胞增殖，可能与其G0/G1细胞周期阻滞，以及PTEN 和P27Kip1蛋白表达上调有关。

前列腺肿瘤;黄酮类;棘豆属;周期素依赖激酶抑制剂p27;基因,肿瘤抑制;细胞凋亡

前列腺癌是危害男性健康最常见的肿瘤之一，其发病率在美国居男性恶性肿瘤之首，占男性死亡原因的第二位[1]。在中国前列腺癌的发病率虽远低于西方国家，然而近20年来，随着居民生活方式的改变、平均寿命的延长及医学诊疗水平的提高，我国前列腺癌的发病率也呈现逐年上升趋势，并且发病年龄也日趋年轻化[2]。局限性前列腺癌可以采用观察随访、前列腺全切术和放疗等治疗手段，但我国大部分患者在确诊时已伴有远处转移。对于晚期前列腺癌患者，内分泌治疗是最主要的治疗方法。但大部分前列腺癌患者在进行18～24个月持续内分泌治疗后，会进展为雄激素非依赖性前列腺癌(androgen independent prostate cancer,AIPC)[3]。对于AIPC目前尚无有效的治疗手段,化疗作为二线治疗方法被应用，但存在着选择性差、毒副反应大及肿瘤细胞耐药等问题。目前临床迫切需要针对AIPC有效且毒副作用小的治疗药物。本研究考察了棘豆素(2′,4′-dihydroxychalcone,TFC)对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞的作用，并初步探讨其作用机制。

1　材料与仪器

TFC (纯度大于 95%) 按照吕芳等[4]的方法提取，其结构如图1所示。TFC以二甲亚砜(DMSO)助溶，DMSO最终浓度为1.0% (v/v)，并经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4 ℃保存待用。F-12培养基购自Life technologies (美国)；胎牛血清购自Invitrogen (美国)；CCK-8试剂盒和Hoechst 33258试剂盒均购自碧云天 (江苏南通)； Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒和Cycletest plus DNA Reagent kit均购自BD Pharmingen (美国)；antiP27kip1 (D69C12,#3686)、antiPTEN (D4.3,#9188)和antiβ-actin (13E5,#4970)均购自Cell Signaling Technology (美国)；鼠抗兔二抗购自Abcam公司(英国)。Becton Dickinson流式细胞仪 (美国)； CO2细胞培养箱(Thermo，美国)；酶标分光光度读板仪(Bio-Rad 680，美国)；超净工作台(苏州净化设备厂)；Nikon倒置显微镜(日本)，ECL 发光试剂盒(上海普飞)。

图1　TFC结构图

2　方法

2.1细胞培养人前列腺癌细胞株PC-3购自中国科学院上海细胞库，选用含10%胎牛血清的F-12培养液培养，培养液中青霉素、链霉素的浓度为100 U·mL-1，于37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱常规培养，待细胞满至80%左右时，用0.25%胰酶消化、传代。

2.2TFC对PC-3细胞增殖的影响取处于对数生长期的PC-3细胞，消化、吹打成单细胞悬液，每孔98 μL接种于96孔板中(细胞密度约每孔5×103个细胞)，次日每孔加入2 μL的TFC，最终浓度分别为12.5、25、50、 100、200 μmol·L-1，每组3个复孔，同时设立对照组(1%二甲基亚砜DMSO)，TFC作用24 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，混匀后，置于培养箱中继续孵育4 h，然后置于酶标分光光度读板仪下测定各孔中的吸光值(测定波长450 nm，参比波长650 nm)。按下面公式计算细胞抑制率：细胞抑制率(%)=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。

2.3TFC对PC-3细胞形态的影响取对数生长期的细胞以每孔5×105个细胞接种于六孔细胞培养板，孔中预先放入经高温灭菌处理的小盖玻片，待细胞爬片后，加TFC处理,使其终浓度分别为25、50、100 μmol·L-1，对照组用1% DMSO处理。加药处理24 h后，吸尽培养液，加入0.5 mL固定液固定10 min。去固定液，用PBS洗2遍，加入0.5 mL Hoechst 33258染色液染色5 min，用摇床晃动 2～3 min。去染色液，用PBS洗2遍。滴1滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。置荧光显微镜下观察拍照，激发波长350 nm，发射波长460 nm。

2.4TFC对PC-3细胞凋亡率的影响将细胞以每孔1.0×106个细胞的密度接种于六孔板中，待细胞贴壁后去培养液，加入980 μL的培养液和20 μL不同浓度的TFC，使其终浓度分别为50、100、200 μmol·L-1，同时设立对照组(1% DMSO)。药物作用24 h后将细胞培养液吸出至离心管内，PBS洗涤贴壁细胞1次，用胰酶消化细胞，合并收集的细胞液，1 000 g离心5 min，弃上清，用PBS洗涤细胞2次，Annexin V-FITC结合液(1×)轻轻重悬细胞，使细胞浓度达到每毫升1.0×106个细胞，取100 μL 的细胞悬液至5 mL的离心管中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，轻轻混匀，避光放置15 min，再加入400 μL Annexin V-FITC结合液(1×)，在1 h内使用流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。

2.5TFC对PC-3细胞周期的影响细胞准备和药物处理同细胞凋亡率实验，待TFC作用24 h后将细胞收集，用70%乙醇固定过夜，然后按照Cycletest plus DNA Reagent kit说明书的要求处理细胞，用流式细胞仪检测细胞周期的变化。

2.6Western blot检测P27kip1和PTEN蛋白的表达细胞准备和药物处理同细胞凋亡率实验，待TFC作用24 h后收集细胞，离心，PBS洗2次，加入一定量的细胞裂解液，置冰上裂解30 min。将裂解液移入eppendorf管中，12 000 g离心2 min，吸上清。取2～5 μL考马斯亮蓝G-250进行蛋白定量，其余样品按比例加入3×SDS凝胶上样缓冲液中溶解，煮沸5 min。取20 μg蛋白样品进行15%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。恒压条件下，积层胶内电泳电压为80 V，分离胶电压为100 V。在50 V恒压的条件下、将凝胶置于转移体系中转膜4 h，将蛋白转至PVDF膜上；将膜置于封闭液中封闭2 h；用PBST简单清洗后将膜置于一抗稀释液中4 ℃过夜；之后用PBST清洗6次，每次10 min；将膜置于二抗稀释液中，室温孵育2 h；再用PBST清洗6次，每次10 min；ECL发光3～5 min，暗室内X光片感光、显影、定影、观察。

3　结果

3.1TFC对PC-3细胞增殖的影响实验结果表明TFC对PC-3细胞具有明显的抑制作用，TFC浓度为25、50、100、200 μmol·L-1时，对PC-3细胞的抑制率分别为9.19%,57.49%,73.48% 和98.49%，呈明显的剂量效应关系。其中50、100、200 μmol·L-1组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1　TFC对PC-3细胞增殖的影响(n=9)

注：与对照组相比，aP<0.01。

3.2TFC对PC-3细胞形态的影响Hoechst 33258为可通过细胞膜的特异性的 DNA 染料，在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散状的均匀荧光，而凋亡细胞的细胞核或细胞质内可出现浓染致密的颗粒块状荧光。对照组PC-3 细胞的细胞核大多呈弥散均匀荧光，且荧光较弱，随着TFC给药浓度的增加，细胞核出现明显的凋亡形态学改变，细胞核出现固缩,呈致密强荧光，并向核膜靠拢,部分细胞核呈新月状或碎裂成小块状。见图2。

图2　TFC对PC-3细胞形态的影响(×400)

3.3TFC对PC-3细胞凋亡率的影响对照组的凋亡率为(6.25±1.47)%，50、100、200 μmol·L-1的TFC作用PC-3细胞24 h后凋亡率分别为(44.58±7.19)%、(85.05±2.14)%和(93.62±3.08)%，具有明显的量效关系，其中50、100、200 μmol·L-1组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2　TFC对PC-3细胞凋亡率的影响(n=3)

注：与对照组相比，aP<0.01。

3.4TFC对PC-3细胞周期的影响对照组G0/G1期细胞比例为(44.88±1.45)%，50、100、200 μmol·L-1的TFC作用PC-3细胞24 h后细胞周期分布发生明显的变化，其中G0/G1期细胞比例分别达到(81.77±5.53)%、(88.05±2.79)%和(90.27±1.26)%，与对照组比较差异有统计学意义(P< 0.01)，TFC导致PC-3细胞发生了明显的G0/G1期阻滞，见表3。

表3　TFC对PC-3细胞周期的影响

注：与对照组相比，aP<0.01。

3.5TFC对P27kip1和PTEN蛋白表达的影响β-actin在对照组和TFC 50、100、200 μmol·L-1组的表达均较稳定，P27kip1和PTEN在TFC的作用下蛋白表达量均显著增加，且有明显的量效关系，见图3。

图3　TFC对P27kip1和PTEN蛋白表达的影响

4　讨论

TFC是从豆科棘豆属(Oxytropis D.C.)植物镰形棘豆的干燥全草中提取的单体黄酮类化合物。黄酮类化合物是镰形棘豆的主要有效成分，除了具有抑菌[5]、抗炎镇痛[6]、抗氧化[7]等药理活性，还对多种肿瘤细胞具有抑制作用。顾青等[8]报道2′，4′-二羟基查耳酮对人肝癌细胞HepG2、小鼠黑色素瘤细胞B16F10、人肝癌细胞SMMC-7721、人肝癌细胞HuH7以及人乳腺癌细胞MDA-MB-23l五种肿瘤细胞的增殖均有明显的抑制作用。杨光明等[9-11]研究发现镰形棘豆黄酮类成分能抑制SMMC-7721细胞的增殖，可能与其下调MMP-2的转录水平、下调Bcl-2基因表达和降低Bcl-2/Bax的比值有关，并对H22荷瘤小鼠也有抑制肿瘤生长的作用。陈醒等[12]研究发现镰形棘豆总黄酮抑制 SMMC-7721细胞的增殖与其诱导细胞周期阻滞和使细胞形态发生变化而引起细胞凋亡有关。Lou等[13]报道了棘豆素具有诱导人胃癌细胞MGC-803凋亡的作用，与其下调survivin mRNA表达有关。虽然镰形棘豆黄酮类化合物对多种肿瘤细胞具有较好的抗肿瘤活性，但其对人前列腺癌细胞未见相关的研究报道。本研究考察了TFC对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞的作用，研究发现TFC对PC-3细胞具有明显抑制增殖的作用，通过Hoechst 33258染色观察TFC对PC-3细胞形态的影响，发现随着TFC给药浓度的增加，细胞核出现明显的凋亡形态学改变。进一步使用流式细胞仪观察TFC对PC-3细胞凋亡率和细胞周期的影响，结果显示TFC能明显诱导PC-3细胞凋亡并引起G0/G1期阻滞，且有明显的剂量效应关系。

P27Kip1基因是一种非特异性细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 (cyclin dependent kinases inhibitors,CDKI)，通过抑制细胞周期素-细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-CDK)复合物的生物活性参与细胞周期调控，使细胞不能通过G1期。P27kipl蛋白水平与前列腺癌的恶性程度、临床分期、淋巴结转移以及预后均存在明显的负相关。PTEN基因是1997年美国3个研究小组分别发现并命名的第1个具有磷酸酯酶活性的抑癌基因，由于其对磷酸化的丝/苏氨酸和酪氨酸残基具有去磷酸化作用而对细胞增殖起负调节效应。肿瘤细胞中PTEN的过表达可使细胞周期发生G1期阻滞，还有增加细胞凋亡率的作用。PTEN基因的失活或突变与前列腺癌等多种肿瘤的发生和发展密切相关。已有研究证实，P27Kip1可能是PTEN所调控的重要的下游分子，是PTEN发挥抑癌作用的关键调节因子[14]。

为了进一步研究TFC诱导PC-3细胞凋亡的分子机制，本研究通过Western blot检测了前列腺癌相关P27kip1和PTEN蛋白的表达，结果发现在TFC的作用下PC-3细胞的P27kip1和PTEN蛋白表达均呈现上调趋势，推测TFC可能是通过上调PTEN表达从而引起P27Kip1表达的增加，导致PC-3细胞发生G0/G1期阻滞，诱导细胞凋亡的发生。本研究提示TFC可能是人雄激素非依赖性前列腺癌潜在的治疗药物，其作用机制还需进一步深入研究。

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2′,4′-dihydroxychalcone-induced apoptosis of PC-3 human prostate cancer cells via up-regulation of P27kip1 and PTEN

SHEN Feng,WANG Yan,ZOU Mingchang,et al

(DepartmentofPharmacy,FirstRenminHospital,Zhenjiang,Jiangsu212002,China)

ObjectiveTo explore the effect of 2′,4′-dihydroxychalcone (TFC) on androgen-independent prostate cancer PC-3 cells and its possible anti-cancer mechanism.MethodsThe CCK-8 assay was employed for cellular proliferation measurement,Hoechst 33258 dye and fluorescent microscope for morphological observation,flow cytometry (FCM) for detection of apoptosis and cell cycles,Western blot for analyzing the expression of P27kip1 and PTEN proteins in PC-3 cells treated with TFC of different concentration.ResultsTFC significantly inhibited the proliferation of PC-3 cells,induced apoptotic morphological features,increased the percentage of apoptosis,arrested cell cycle in G0/G1 phase,up-regulated the expression of P27kip1 and PTEN proteins in a concentration dependent manner.ConclusionsTFC could inhibit the proliferation and induce the apoptosis in PC-3 cells by up-regulating P27kip1 and PTEN protein and arresting cell cycle in G0/G1 phase.

Prostatic neoplasms;Flavones;Oxytropis;Cyclin-dependent kinase inhibitor p27;Genes,tumor suppre;Apoptosis

盛玉青，女，副主任中药师，研究方向：中药药理，E-mail：syq770330@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.011

2016-03-16,

2016-06-14)